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食品工业科技 Science and Technology of Food Industry 研究与探讨 72 2007年第09期 蜡样芽孢杆菌在营养肉汤和维也纳香肠中的 生长模型及控制 仪淑敏 1 ,李远钊 2 ,张培正 1,3 ,梁 浩 3 ,朱英莲 4 (1 1 云南农业大学食品科技学院,云南昆明650012; 21 烟台出入境检验检疫局,山东烟台264003; 31 山东龙大集团,山东烟台264003; 41 莱阳农学院食品科学与工程学院,山东青岛266109) 摘 要:主要研究了在不同氯化钠浓度、pH、 温度条件下营养肉汤 中蜡样芽孢杆菌生长状况,建立了25、37 下蜡样芽孢杆 菌在营养肉汤中和维也纳香肠中的生长模型。根据研究 结果提出了在维也纳香肠生产过程中蜡样芽孢杆菌的控 制措施。 关键词:蜡样芽孢杆菌,营养肉汤,维也纳香肠,生长模型,控制 Abstract:The g row th s ta tus of Bac illus ce reus a t d iffe rent NaC l concentra tion, pH andtemp e ra tureinthenutritiona l b roth we re s tud ied and the op ti m a l g row th cond itions we rede te rm ined1Thiss tudy a lso deve lop ed m a th - em a tic m ode ls for Bac illus ce reus g row th in nutritiona l b roth andin W iene rwurs t a t 25, 371Accord ingto these results we p resent som e m easures to control the Bac illusce reusinthep roduc tionp rocessof W iene rwurs t1 Key words:Bac illus ce reus; nutritiona l b roth; W iene rwurs t; m a th- em a tic m ode l ; control 中图分类号: TS25111 文献标识码:A 文 章 编 号: 1002- 0306(2007) 09- 0072- 04 收稿日期: 2007- 01- 12 3 通讯联系人 作者简介:仪淑敏(1980- ) ,女,在读研究生,研究方向:食品质量与 安全。 基金项目:国家“ 十五 ” 重大科技专项,食品安全关键技术的综合示范 (2001BA804A29)。 蜡样芽孢杆菌分布广泛,常见于土壤、 灰尘和污 水中,植物性食品和许多生熟食品中也常见,是一种 好氧性、 可以形成芽孢的革兰氏阳性杆菌,但是它在 厌氧情况下也可以很好地生长 1 。较早报道的蜡样 芽孢杆菌食物中毒是在1973年Bulyba等人报道的 污染蜡样芽孢杆菌的乳制品引起食物的中毒 2 。 19942003年十年内,国内报道的蜡样芽孢杆菌食物 中毒共47起,其中进食人数2541人,中毒者1758 人,发病率69119% ,但是无一人死亡 3 。近几年又有 文章报道了由蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒。蜡样 芽孢杆菌食物中毒有明显的季节性,通常以夏秋季 (6 10月)最高。食物中毒分为呕吐型和腹泻型,潜 伏期分别为0155h和816h,其毒素分别是小分子 量、 热稳定的多肽和大分子量的蛋白。一般的食物 热处理不能使其失活(耐热性的肠毒素需100经 20min才能破坏)。毒素的产生量在较低温度下更多 (12 15) 4 。本实验研究了蜡样芽孢杆菌的生长 特性及其在营养肉汤和维也纳香肠中的生长模型, 同时还研究了维也纳香肠生产过程中的蜡样芽孢杆 菌污染情况。 1 材料与方法 111 材料与设备 蜡样芽孢杆菌(编号: 11230) 青岛出入境检验 检疫局;维也纳香肠 维也纳香肠真空包装Co60辐照 后, - 18 保存备用;营养肉汤、 平板计数琼脂、 多粘 菌素B、 胰酪胨大豆多肉汤、 营养琼脂 青岛高科园 海博生物技术有限公司; NGKG培养基(蜡样芽孢杆 菌选择性培养基)日本进口; HCl 莱阳市双双化工 有限公司; NaC1、KOH、KH2PO4 天津市化学试剂二 厂,以上试剂均为分析纯。 拍击式均质器 法国Interscience公司;灭菌锅 山东新华医疗器械有限公司;恒温培养箱 山东 潍坊医疗器械厂;生化培养箱 武汉瑞华仪器设备 有限责任公司;酸度计 梅特勒一托利多仪器有限 公司;电子天平 上海精密科学仪器有限公司; 1mL 加样器 德国eppendorf公司。 112 实验方法 11211 试剂的配制 1121111 营养肉汤、 平板计数琼脂、 营养琼脂培养基、 NGKG培养基的配制 按照其要求配制。 1121112 磷酸盐缓冲稀释液的配制 在500mL蒸馏水 中溶解KH2PO43410g,用1mol/L NaOH溶液175mL校 正pH至712,再用蒸馏水稀释至1000mL,制成储备液 于冰箱中储存。取原液1125mL,用蒸馏水稀释至 研究与探讨 食品工业科技 Vol.28, N o.09,2007 2007年第09期 73 1000mL,分装9mL /管,121 灭菌15min后备用。 1121113 胰酪胨大豆多粘菌素肉汤的配制 按培养 基瓶显示要求溶解胰酪胨大豆肉汤在蒸馏水中,煮 沸2min,分装大试管,每管15mL, 121高压灭菌 15min。临用时每管加入015%多粘菌素B溶液 011mL混匀即可。 11212 接种 以无菌操作取蜡样芽孢杆菌琼脂斜面 1824 h的培养物,在无菌磷酸盐缓冲液中制成菌悬 液, 80 水浴5min后(可以将蜡样芽孢杆菌菌体致 死,而其芽孢依然存在活性 ) , 适当稀释后使其浓度 达到10 3 10 4 cfu/mL,取1mL接种。 11213 倒平板计数法测菌数 以无菌操作取1mL不 同稀释梯度的培养液,置于培养皿中,每个梯度做两 个平行,然后倒入15mL左右46 的平板计数琼脂培 养基,等平板计数琼脂培养基凝固后,倒放置于37 培养箱中培养1220h后计数,同时做空白对比。 11214 最适生长条件的测定 1121411 NaCl浓度对蜡样芽孢杆菌生长的影响 分 别配制NaCl浓度为0%、5%、315%、615%、915%、 1215%、1515%、1815%营养肉汤(pH618714) ,加热溶 解后分装9mL /管,每个浓度分装2管, 121灭菌 15min。接种,摇匀,置于37 培养箱中培养 8h ( 接 种量2040cfu/mL)。倒平板计数法测菌数。 1121412 pH对蜡样芽孢杆菌生长的影响 配置 9mL /管的营养肉汤(NaCl浓度为015% ) ,用011mol/L HC1和011mol/L NaOH溶液调pH分别为2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11,每个水平分装2管, 121灭菌 15min。接种,摇匀,置于37 培养箱中培养8h (接 种水平280个/ mL)。倒平板计数法测菌数。 1121413 温度对蜡样芽孢杆菌生长的影响 配置 9mL /管的营养肉汤(NaCl浓度为015% ) 24管,接种 后放置到10、15、20、25、30、32、34、37、39、44、50、 55 培养箱中,每个温度放2管。培养12h (接种水 平4450cfu/ mL)。倒平板计数法测菌数。 1121414 营养肉汤中蜡样芽孢杆菌生长曲线的确定 配置9mL /管的营养肉汤(NaCl浓度为015% )若干 管,接种后放置于不同温度下培养,每隔一定温度取 2管,倒平板计数法测菌数。用curxpt软件绘制营养 肉汤和维也纳香肠中蜡样芽孢杆菌的生长曲线,得 出回归模型。 1121415 维也纳香肠中蜡样芽孢杆菌生长曲线的确 定 取蜡样芽孢杆菌营养琼脂斜面1824h培养物, 在无菌的磷酸盐缓冲液中制成菌悬液, 80水浴 5min后,进行适当稀释。按无菌操作,取维也纳香肠 500g,切成1g左右的肉丁后放入菌悬液中浸泡 1min,沥水1min后(使接种水平保持在10 2 10 4 cfu/mL)放入若干个无菌的培养皿中,不同温度下厌 氧培养。每隔一定时间取1份,加9倍无菌磷酸盐缓 冲液,均质后取均质液1mL,用稀释倒平板法测菌数 (每次做2个平行)。用curxpt软件绘制维也纳香肠 中蜡样芽孢杆菌的生长曲线,得出回归模型。 1121416 环境检测方法 称取样品50g放于无菌均 质杯中,加入450mL无菌磷酸盐缓冲稀释液,以 1800020000r/min均质2min,制成110样品稀释 液。用无菌涂抹棒涂抹车间环境10cm 2 ,然后放入 10mL无菌磷酸盐缓冲稀释液中,制成110稀释液。 取10、100、1000三种稀释液,每种稀释液接种3 管胰酪胨大豆多粘菌素肉汤,每管接种1mL。置于 30 培养482h。从长菌的试管取培养物划线接种 到NGKG琼脂平板上。置37 培养2448h。根据 NGKG琼脂平板上是否长蜡样芽孢杆菌,确定为蜡样 芽孢杆菌的管数,由MPN表计算蜡样芽孢杆菌的 MPN值/g(MPN值/ cm 2 )。 11215 维也纳香肠的生产加工工艺 生猪屠宰 分割 制陷灌肠 干燥、 烟熏、 蒸煮 预冷 包装 冷冻 倒包装 冷冻 出售 其中初加工车间生产工艺包括分割、 制陷灌肠; 精加工车间生产工艺包括预冷、 包装(包括剪头、 筛 选、 包装、 密封)。 2 结果与讨论 211 不同条件下营养肉汤中蜡样芽孢杆菌的生长 情况 21111 营养肉汤中NaCl浓度对蜡样芽孢杆菌的影响 由图1可以看出,蜡样芽孢杆菌在NaCl浓度为 015%315%之间可以较好地生长,但是NaCl浓度的升 高对蜡样芽孢杆菌的生长有一定的抑制作用,在315% 615%之间明显受到抑制, 615%1815%之间生长情况 变化不大,即菌体不生长或生长缓慢,但不死去。 图1 NaCl浓度对蜡样芽孢杆菌的影响 图2 温度对蜡样芽孢杆菌的影响 21112 营养肉汤中温度对蜡样芽孢杆菌的影响 由 图2可以看出,蜡样芽孢杆菌在15 以下生长缓慢 甚至死亡, 2530 生长良好,最适温度在3039 之 间, 3944 生长良好, 44 以上生长缓慢甚至死亡, 50 以上12h以后菌体99%已经死亡。 食品工业科技 Science and Technology of Food Industry 研究与探讨 74 2007年第09期 21113 营养肉汤中pH对蜡样芽孢杆菌的影响 由 图3可以看出,蜡样芽孢杆菌在pH24之间基本不 生长, pH46之间生长缓慢, pH69之间生长良好, 在pH9以上生长受到抑制,甚至死亡。 图3 pH对蜡样芽孢杆菌的影响 212 蜡样芽孢杆菌在营养肉汤中的生长模型 由图4可以看25 蜡样芽孢杆菌在营养肉汤中 生长 的Richards Model:方 程 拟 合 曲 线 为: y = 161798765 / 1 + exp (61656- 0146762491x) 1 /48553941 y:为对应时间时的菌数; x:为培养时间。 图4 25 营养肉汤中的生长曲线 注: N为对应时间时的菌数; Ln是以e为底的对数; r 为相关系数。 由图5可以看37 蜡样芽孢杆菌在营养肉汤中 生长的MMF Model:方程拟合曲线为: y = (7129 4413 +17129x 31153 ) / (4413 + x 31153 ) y:为对应时间时的菌数; x:为培养时间。 图5 37 营养肉汤中的生长曲线 注: N为对应时间时的菌数;Ln是以e为底的对数; r为 相关系数。 213 蜡样芽孢杆菌在样品中的生长模型 由图6可以看25 蜡样芽孢杆菌在样品中生长 的MMF Model:方程拟合曲线为: y = (75154 + 1914 x 2148 ) / ( 5154 + x 2148 ) y:为对应时间时的菌数; x:为培养时间。 图6 25 样品中的生长曲线 注: N为对应时间时的菌数; Ln是以e为底的对数; r 为相关系数。 由图7可以看37 蜡样芽孢杆菌在样品中生长 的MMF Model:方程拟合曲线为: y = (6153316317 +1717x 3146 ) / ( 316317 + x 3146 ) y:为对应时间时的菌数; x:为培养时间。 图7 25 样品中的生长曲线 注: N为对应时间时的菌数;Ln是以e为底的对数; r 为相关系数。 214 环境检测结果 环境样本共142个, 1813% (26个)样品结果大 于3MPN /cm 2 ;维也纳香肠初加工车间、 精加工车间 原料肉及成品30个, 9313% (28个)样品结果大于 3MPN /g。 215 讨论 21511 NaCl浓度的控制 虽然NaCl浓度在015% 315%之间蜡样芽孢杆菌可以较好地生长,但是NaCl 浓度的升高对其生长有一定的抑制作用。所以,可 以在人口感可以接受的范围内,向维也纳香肠增加 NaCl的添加量,有利于控制蜡样芽孢杆菌的生长。 但是在整个生产过程中, NaCl的浓度较低且变化不 大,改变NaCl的浓度意义不大。 21512 温度的控制 在维也纳香肠加工过程中,应 研究与探讨 食品工业科技 Vol.28, N o.09,2007 2007年第09期 75 该尽量降低加工环境的温度,以减缓微生物的生长 繁殖。熏蒸以后(不能使蜡样芽孢杆菌的芽孢死掉) 刚出炉的维也纳香肠温度一般较高 (55 以上 ) , 这 时一般没有蜡样芽孢杆菌菌体存在,但是如果预冷 时处理措施不当很容易孳生微生物,如果加工时间 过长,且温度较高时蜡样芽孢杆菌的芽孢有可能萌 发,所以应该快速使维也纳香肠的温度降下来,缩短 加工时间,降低加工环境温度。 21513 生猪宰前的休息与饲养 动物在宰前糖原消 耗过多,尸僵后肉的pH高,容易出现生理异常肉,猪 肉易引起DFD肉。生产维也纳香肠的主要原料是猪 肉,影响原料肉pH的主要因素是屠宰前所处的状 态,一般活体肌肉的pH保持中性 (7 10712) ,如果宰 前给予充分休息和良好的饲养,死后由于糖原酵解 生成乳酸,肉的pH逐渐下降。正常的猪肉原料在加 工前pH应该是在516518之间。在这个pH范围内 蜡样芽孢杆菌的生长缓慢,在加工过程中pH变化不 大。所以如果加工时用的是屠宰后正常的原料肉, 不必控制pH。但是如果宰前没有给予生猪充分休 息和良好的饲养,宰前生猪处于应激和兴奋状态,宰 后动物组织的pH接近710,这个条件下蜡样芽孢杆 菌生长繁殖较快。因而生猪在屠宰前应给予充分休 息和良好的饲养,屠宰最好使用电击的方法。 21514 生猪宰前的污染控制 在25、37 下建立蜡 样芽孢杆菌在营养肉汤和维也纳香肠中的生长模 型,用curxpt软件拟合的生长曲线,其相关指数较 高,分别为0199710338、0199877837、0199831090和 0199877973。虽然蜡样芽孢杆菌在营养肉汤和维也 纳香肠中生长情况有差别,但是都在经历了一定时 间的延迟期后,进入快速生长的对数生长期。进入 对数生长期,蜡样芽孢杆菌增长的幅度较快。在维 也纳香肠加工中,蜡样芽孢杆菌的来源一般为原料 肉、 加工环境污染等,所以应尽量降低原料肉初始带 菌率,控制加工环境卫生,避免生产过程中的交叉污 染,并控制整个加工流程的时间(尤其是精加工的时 间)。由于蜡样芽孢杆菌是在环境中普遍存在的一 种菌,建立蜡样芽孢杆菌阴性猪群很困难,但也要做 好养猪场的卫生管理,将蜡样芽孢杆菌的污染控制 在一定范围内,故宰前处理非常重要。加强宰前检 验,活猪宰杀前必须进行动物检疫,对有问题的猪进 行适当处理,以避免病猪在加工中污染工器具、 加工 用水以及环境。在宰杀过程中,严格控制各环节的 操作。注意工具的消毒,避免发生交叉污染;加强加 工车间的卫生管理,加强生产用水的消毒,保障生产 用水清洁。 21515 加工车间环境的控制 连续一个月环境样本 共142个, 1813% (26个)样品检出蜡样芽孢杆菌 (MPN 3 /cm 2 ) , 说明车间环境控制有待进一步加 强。采集维也纳香肠初加工车间、 精加工车间原料 肉及成品30个, 9313% (28个)样品结果检出蜡样芽 孢杆菌(MPN 3/g) ,说明整个生产加工工艺不能完 全杀死蜡样芽孢杆菌。原料肉中的蜡样芽孢杆菌的携 带量较多,加工环境也可能污染蜡样芽孢杆菌。由图 2可以看出, 1525 之间蜡样芽孢杆菌可以缓慢生 长,车间生产加工环境一般都在15 以上,所以应该 更进一步控制环境卫生和原料肉中的微生物污染。 3 结论 通过对维也纳香肠和营养肉汤中蜡样芽孢杆菌 生长规律的研究,可以得出蜡样芽孢杆菌的最适 NaCl浓度为0%315% ,最适pH为610910,最适温 度为3039。在维也纳香肠加工过程中,为降低蜡 样芽孢杆菌的污染危害,应该严格控制原料猪肉的 初始带菌率,制定良好的操作规范,保证加工环境和 用水的卫生,避免交叉污染,控制整个加工过程的时 间和温度。 参考文献: 1 Bulyba M S, Kulchskaya I I, Domanskaya E D1Bacillus cereusfood poisoningJ 1Voprosy Pitaniya, 1997(1) : 86871 2吕荣 1食物中毒研究近况J 1中国乡村医药杂志, 2003 (10) : 511 3 BeateFricke,Katharina Dr Mler,Ingo W illhardt A, Angelika Schierhorn , SieglindeMenge , PeterRcknagel1The cell envelope- boundmetalloprotease (camelysin) fromBacillus cereus is a possible pathogenic factor J 1Biochimica et Biophysica Acta, 2001(1537) : 1321461 4 FinlayW J J, Logan N A, Sutherland A D1Bacillus cereus producesmost

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