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文档简介
乙肝两对半测定 酶联免疫法,实习生:廖於波 指导老师:李海龙,HBV是乙型病毒性肝炎的病原体。HBV感染呈世界性流行,但不同地区感染的流行程度差异很大。据WHO报道,全球约20亿人曾感染过HBV,其中3.5亿人为慢性感染者,每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。我国属高流行地区一般地区HBsAg阳性率为7.18%。,乙肝病毒血清标志物,HBsAg 第一个出现,感染后1-2周即可阳性 阳性表示存在HBV感染 HBsAb 出现在HBsAg消失后 保护性抗体 疫苗免疫成功的标志,乙肝病毒血清标志物,HBeAg 病毒复制标志 传染性强 HBeAb 传染性降低 长期存在是DNA与肝细胞整合的结果,乙肝病毒血清标志物,HBcAg HBV复制的标志 血清中难以检测出来 IgM-HBcAb 急性HBV感染 IgG-HBcAb 急性感染恢复期和慢性持续感染,检测HBV病毒血清标志物是临床最常用的病原学诊断方法。HBV具有三个抗原抗体系统,即乙肝表面抗原(HBSAg)和乙肝表面抗体(HBsAb)、e抗原(HBeAg)和e抗体(HBeAb)、核心抗原(HBcAg)核心抗体(HBcAb),由于HBcAg在血液中难于检出,故临床免疫学检测不包括HBcAg,目前常采用酶联免疫法和化学发光法检测。,酶联免疫吸附实验原理,用于检测包被于固相板孔中的待测抗原(或抗体)。即用酶标记抗体,并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面,使抗原抗体反应在固相载体表面进行,用洗涤法将液相中的游离成分洗除,最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。,乙肝病毒血清标志物检测原理,标本本要求,采集: 血浆:使用抗凝血浆管(枸橼酸盐、EDTA盐、肝素之一为抗凝剂)采集样品。样品离心分离后,提取血浆用于检测。 血清:采用正确医用技术采集标本。离心分离后,提取血清样品用于检测。,标本要求,储存:样品可存放于28冰箱,24小时内测定。若需长时间保存,则应冻存于-20以下,避免反复冻融。上述样品使用前应恢复到室温,轻轻摇动混匀。若标本有沉淀物形成,应离心除去,并确定未变质方可使用。严重融血或脂血标本不可使用。,试剂(安图生物),主要组成成分,实验前准备,1.取出试剂盒及待测样品,将所有试剂及样品恢复至室温(1825)。 2.将恒温箱或水浴锅调至反应温度。 3.洗液用蒸馏水作20倍稀释后备用。,检验步骤,排板,检验步骤,表面抗原(两步法) 1.留一孔作空白对照,加入样本稀释液20ul/孔(含空白孔),其他加入阴性对照三孔和阳性对照二孔100ul/孔及待测标本100ul/孔于相应的反应孔内。 2.在微型真当器上振荡30秒使孔内液体混合均匀(该步骤非常重要)。 3.贴上板贴,置37下温育60分钟。,检验步骤,4.撕下板贴,除空白孔外,各孔加入酶结合物50ul。 5.在微型振荡器上振荡30秒使孔内液体混合均匀(该步骤非常重要)。 6.贴上板贴,置37下温育30分钟。 7.撕下板贴,洗板6次,最后在吸水纸上拍干。 8.每孔加入底物液、显色剂各50ul,37避光温育30分钟。,检验步骤,9.加终止液50ul/孔,轻轻振荡混匀后,立即测试结果。 10.使用酶标仪450nm单波长测量各孔的OD值。,检验步骤,表面抗体、e抗原、e抗体、核心抗体(一步法) 1.留一孔空白,三孔加入阴性对照、二孔加入阳性对照各50ul/孔,其他各孔分别加入样本50ul (HBcAb测定时待测血清用生理盐水1:30稀释50ul血清+1.5ml生理盐水) 。 2.除空白孔外,各孔加入酶结合物50ul。 3.在微型真当器上振荡30秒使孔内液体混合均匀(该步骤非常重要)。 4.贴上板贴,置37下温育30分钟。,检验步骤,5.撕下板贴,洗板6次,最后在吸水纸上拍干。 6.每孔加入底物液、显色剂各50ul,37避光反应10分钟。 7.加终止液50ul/孔,轻轻振荡混匀后,立即测试结果。 8.使用酶标仪450nm单波长测量各孔的OD值。,结果判定,1.肉眼判定,结果判定,2.酶标仪判定:用酶标仪单波长450nm或双波长450nm/630nm测定各孔OD值,根据OD值判定结果,注意事项,浓缩洗涤液配制前充分摇匀。 加样本时要加到孔底。 加试剂前应将试剂瓶翻转数次,使液体混匀。 如果滴加,滴加前应弃去1-2滴。,注意事项,滴加时瓶身应保持垂直,以使滴量准确。勿将试剂滴在孔壁上。 洗涤时各孔须加满,防止孔口内有游离酶残留。 洗涤时注意孔与孔之间的交叉污染。 脂血,溶血可影响结果。,注意事项,所有样本都应按传染源处理。 样品显色深浅与样品中抗体的含量没有一定正相关。任何一种测试都不能绝对保证样品中没有低浓度的抗体存在。 不同品名、不同批号的试剂不可混用,以免产生错误结果。,影响检测结果的因素,1.样本采集与处理的影响 1.1 标本严重溶血。 1.2 标本凝固不全:血液还未开始凝固时即强行离心分离血清,使血清中仍残留部分纤维蛋原。 2、试剂的影响 2.1 不同批号。 2.2 不同厂家。,影响检测结果的因素,3.操作技术的影
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