课件：局部给药制剂控制菌检查.ppt

局部给药制剂控制菌检查,金黄色葡萄球菌检查,目,录,局部给药制剂的介绍,金黄色葡萄球菌的介绍,微球菌科、葡萄球菌属,生物学分类,样品信息介绍,操作程序,生化试验及结果判定,局部给药制剂的定义,按照局部给药制剂微生物限度检查规定工作程序和检验操作程序，得到局部给药制剂微生物限度检查常规细菌计数、霉菌和酵母菌计数以及控制菌（铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌）检查结果，并依据执行标准判定结果是否符合规定并报告。,操作及项目标准,环境洁净度：应在1 0 000 级下的局部洁净度100 级的单向流空气区域内进行，检验全过程必须严格遵守无菌操作。,检验结果以1ml为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。,培养温度：本检査法中霉菌及控制菌 培养温度为3035,供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对 微生物无毒性。,资料来源：2010年版中国药典第二部附录 XI J 微生物限度检查法P107,局部给药制剂的途径和剂型,不经胃肠道给药的剂型 （1）注射给药 如静脉注射、肌内注射、皮下注射和皮内注射等。 （2）呼吸道给药 如吸入剂、喷雾剂、气雾剂等。 （3）皮肤给药 如外用溶液剂、洗剂、搽剂、软膏剂、糊剂、贴剂等。 （4）粘膜给药 如滴眼剂、滴鼻剂、含漱剂、舌下片剂、栓剂、膜剂等。一般把直肠给药也归于粘膜给药一类，如灌肠剂、栓剂、直肠用胶囊栓等。,又称冻胶。溶胶或溶液中的胶体粒子或高分子在一定条件下互相连接，形成空间网状结构，结构空隙中充满了作为分散介质的液体，这样一种特殊的分散体系称作凝胶。,用于皮肤的含脂类或油脂类物质(如凡士林、猪油、羊毛脂)为基质的半固体药物制剂,指药物与适宜基质制成的具有一定形状的供人体腔道内给药的固体制剂。,PPT模板下载：/moban/,局部给药制剂的常见剂型,局部给药制剂的分类,4,用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂,1,2,3,5,用于表皮或粘膜不完整的含药材原粉的局部给药制剂,用于表皮或粘膜完整的含药材原粉的局部给药制剂,阴道、尿道给药制剂,直肠给药制剂,6,其他局部给药制剂,微生物限度标准,直肠给药制剂： 细菌数：每1ml不得过100cfu 霉菌和酵母菌数：每1ml不得过100cfu 铜绿单孢菌：每1ml不得检出 金黄色葡萄球菌：每1ml不得检出,资料来源：2010年版中国药典第二部附录 附录XIJ 微生物限度检查法P115微生物限度标准,产品介绍,【药品名称】 通用名称：开塞露（含甘油） 英文名称：Glyceine Enema 汉语拼音：Kaisailu 成份：本品每支含主要成份甘油52.8-58.3%。辅料为：纯化水 性状：本品为无色、澄清的粘稠液体 作用类别：本品为缓解泻药类非处方药药品 适应症：用于便秘,样品信息,规格：10ml/支 有效期：24个月 执行标准：国家药品标准WSI-XG-018-2011 批准文号：国药准字H44023815 说明书修订日期：2012年02年29日 储藏：遮光，密封，在干燥处保存 不良反应：尚不明确 禁忌：尚不明确,请检单,金黄色葡萄球菌的简介,金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus ) 是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌（Staphylococcus），有“嗜肉菌“的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染。而对于金黄色葡萄球菌在速冻食品中的存在量，卫生部于2011年11月24日公布食品安全国家标准速冻面米制品，允许金葡菌限量存在。,病原微生物又可称为病原菌，是指能入侵宿主引起感染的微生物，有细菌、真菌、病毒等。 病原菌为什么会使人生病呢？是因为它们能产生致病物质，造成宿主感染。如果不产生致病物质，就是非病原菌。至于正常菌群，当与宿主处于生态平衡状态，它们并不引起机体的感染，故属于非病原菌范畴。但是，在特定条件下，因为菌群失调、宿主免疫功能低下或菌群寄居部位改变造成了生态失调状态，正常菌群也能引起感染，这样它们又应看成病原菌。为此，将这些正常菌群称为条件性病原菌或机会性病原菌，意思是在特殊条件下或遇到合适机会时，它们也可以具有病原菌的特性，造成人类感染性疾病。,什么 是病原菌？,致病性,金黄色葡萄球菌为条件致病菌，菌株致病力的强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶： a.溶血素：外毒素，分、四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死； b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞； c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关； d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌； e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E五种。,什么是条件致病菌？,条件致病菌又称为机会致病菌，在某种特定的条件下可致病的细菌，称为条件致病菌，条件致病菌是人体的 正常菌群，当其集聚部位改变、机体抵抗力降低或菌群失调时可致病，如病形杆菌。,致病性,金黄色葡萄球菌 是人类化脓感染中最常见的病原菌，临床表现多种多样，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。,葡萄球菌皮肤感染,分布,在自然界中广泛存在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。 作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，50%以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的机会很多。 传播媒介为被该菌污染的食品，主要为淀粉类(如剩饭、米面、粥等)、牛乳及乳制品，以及鱼、肉、蛋类等。被污染的食物在室温20-22放置5小时以上时，病菌大量繁殖，并产生肠毒素。,生物学分类,域： 细菌域 Bacteria 门： 厚壁菌门 Firmicutes 纲： 芽孢杆菌纲 Bacilli 目： 芽孢杆菌目 Bacillales,科： 微球菌科 Staphylococcaceae 属： 葡萄球菌属 Staphylococcus 种： 金黄色葡萄球菌 S. aureus,伯杰氏手册 681,金黄色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus Rosenbach),1、形态与染色：(staphylococcus aureus) 典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8m左右，显微镜下排列成葡萄串状。 金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛， 大多数无荚膜。 革兰氏染色阳性。,培养特性： 金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，加少量葡萄糖或血液生长更旺盛需氧或兼性厌氧，最适生长温度37，最适生长pH 7.4。 金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在7.515%NaCl肉汤中生长。 平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。,微球菌科（Micrococcaeae Pribram ) 的特征,细胞球状，直径0.53.5微米，可向几个平面分裂为其特征，形成规则或不规则的堆团或立方堆，运动或不运动。无休眠期。革兰氏阳性。 化能异养菌，呼吸或发酵代谢。当分解葡萄糖时产酸不产气。 好氧或兼性厌氧。 营养要求是可变的。所有的菌株能在5%的NaCl中生长，有许多菌株能在10-15%的NaCl中生长。 DNA的G+C含量范围约为3075克分子% 同科菌属：微球菌属 葡萄球菌属 动性球菌属,引起毒素型食物中毒 分为：金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 腐生性葡萄球菌,葡萄球菌属（Staphylococcus）,对于加工过的食品或食品加工设备而言，此菌或其肠毒素的存在通常作为卫生条件差的一种指标。,金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片,葡萄球菌属（StaphylococcusRosenba）的特征,细胞球状，直径0.5-1.5微米。 不运动，没有休眠阶段。 革兰氏阳性。 化能异养菌，呼吸代谢和发酵代谢。 产生细胞外酶和毒素。可水解多种蛋白质和含脂肪的底物。可能分解马尿酸盐和精氨酸。不形成吲哚。 好氧生长要求氨基酸和维生素类。 大多数在15%NaCl或40%的胆汁中可以生长。 资料出自伯杰氏手册669页,金黄色葡萄球菌,生化特性： 可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。 许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。 金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。,项目进程表,供试品,供试液,亚碲酸钠肉汤（或营养肉汤）,卵黄高盐琼脂平板,甘露醇高盐琼脂平板,营养琼脂斜面,革兰氏染色镜检,血浆凝固酶试验,报告,培养温度：361 培养时间：1824h，必要时可延长至48h,培养温度： 361 培养时间：2472h,分离培养,增菌培养,纯培养,流 程 图,供试液的制备,取样品10ml加入,用量筒量取无菌水 90ml于空瓶中,用玻璃棒搅拌，使 混合均匀,供 试 液,阳性：10ml供试液+1ml菌液,样品：10ml供试液,阴性：10ml缓冲液,营养肉汤（亚碲酸钠）增菌液各100毫升,供试液,缓冲液,营养 肉汤,营养 肉汤,营养 肉汤,培养温度：361 培养时间：1824h 必要时可延至48h 阴性对照应无菌生长,增菌,增菌备料单,营养肉汤培养基100mlX2 玫瑰红钠琼脂培养基150ml 氯化钠蛋白胨水150ml 移液管1mlX5 10mlx2 试管2支 平皿x8 玻璃棒x1 100ml量筒x1 空三角瓶,营养肉汤培养基,亚碲酸盐肉汤培养基：临用前，取灭 菌的营养肉汤培养基，每100m加入新 配置的1%亚碲酸钠（鉀)l试液0.2ml， 混匀，即得。,亚碲酸钠的作用是一直其他 菌生长，起选择作用,取上述成份混合，微温溶解，调节pH 为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH值使灭 菌后为7.20.2,分装，灭菌。,分离培养,增菌培养液,阳性,样品,四驱划线,卵黄氯化钠琼脂平板,甘露醇琼脂平板,以接种环沾取1-2 环 培养液，划线接种,培养温度： 361 培养时间：2472h,分离培养备料单,平皿1x4 卵黄氯化钠琼脂培养基40ml 甘露醇氯化钠琼脂培养基40ml,卵黄氯化钠琼脂培养基：,除10%氯化钠卵黄液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH7.60.1,待冷至60 以无菌操作加入10%氯化钠卵黄液，充分混匀，勿振摇，倾注平皿。10%氯化钠卵黄液的制备取新鲜鸡蛋1 个，以无菌操作取出卵黄，放入10%氯化钠溶液100ml 中，充分混匀。,甘露醇氯化钠琼脂培养基,除甘露醇、指示液和琼脂外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH 使灭菌后为7.40.2，加入琼脂，加热溶化后，滤过，分装，灭菌，冷至60，倾注平皿。,金黄色葡萄球菌在两种选择性培养基上菌落的形态特征,挑取疑似菌落接 种于营养琼脂斜面,于36培养箱培养 1824h,取斜面培养物进行 革兰氏染色，镜检,营养 肉汤,于36培养箱培养 1824h,纯培养,纯培养备料单,营养琼脂斜面10mlx4,营养琼脂培养基,取上述成分，混合。微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入14g琼脂，调节pH值使灭菌后为7.20.2，灭菌。,革兰氏染色、镜检,1、以接种环蘸取无菌水与洁净载玻片上，取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温干燥，再通过火焰23次（载玻片不烫手）固定。 2、滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。 3、滴加碘液，媒染1min，水洗，以滤纸吸干余水。 4、滴加95%乙醇，脱色2030s，水洗。 5、滴加沙黄染液，复染1min,待干后，镜检。 6、染色结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，球状。,生化试验,原理：血浆凝固酶是一种含有枸橼酸钠或肝素抗凝剂的人或兔的血浆发生凝固的酶类物质。致病性葡萄球菌大多能产生凝固酶，非致病葡萄球菌不产生此酶，试管血浆呈凝固者为阳性反应，不凝固者为阴性反应。,阳性 阴性,致病菌,血浆凝固酶,使血浆凝固,分 类,游离性凝固酶 分泌至细菌体外 被血浆中凝固酶反应因子激活，形成葡萄球菌凝血酶。 使纤维蛋白原变为纤维蛋白，导致血浆凝固。 采用试管法检测,结合型凝固酶 在菌体表面 与纤维蛋白原结合，使纤维蛋白原变为纤维蛋白。 引起细菌凝集 采用玻片法检测,操作步骤（供试液制备）,1、软膏、乳膏剂 先将已备妥的含5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80的混合物加热至融化，待冷至45时，加入供试品5g（或5ml），立即用玻璃棒搅拌均匀，分次少量慢慢加入45的pH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至80ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1:20供试液 2、油剂 去供试品10ml，加入58ml无菌聚山梨酯80，摇匀，再加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml。,3、取缓冲液90ml于空的三角瓶中，加入样品10ml，用玻璃棒搅拌，使混合均匀，即得供试液。,操作步骤（增菌培养）,取营养肉汤（或亚碲酸钠肉汤）培养基2 份，每份100ml，1份加入10ml供试液，另一份加入与供试液等量的pH7.0 无菌氯化钠蛋白胨缓冲液作为阴性对照，置36摄氏度培养1824（必要时可延至48h;）。阴性对照应无菌生长。,操作步骤（分离培养）,分离培养将上述供试品增菌培养液，以接种环沾取1-2 环培养液，划线接种于卵黄氯化钠琼脂平板或甘露醇氯化钠琼脂平板上，置361培养24-72h。当供试品分离平板无菌落生长，或有菌落生长但不同于下列表格的特征时，可报告为1g或1ml供试品未检出金黄色葡萄球菌。,纯培养,当供试品分离平板生长菌落与上表所列菌落特征相似或疑似时，应选取2-3个以上菌落，分别用接种针轻轻蘸取菌落中心表面培养物，接种于营养琼脂斜面上，于36摄氏度培养18-24h，取营养琼脂斜面培养物进行革兰氏染色镜检，以及接种营养肉汤培养基中于36摄氏度培养18-24h，做血浆凝固酶试验。,血浆凝固酶试验,试管法：取无菌试管（100mmx100mm）3支，各加入血浆和0.9%无菌氯化钠溶液（1:1）0.5ml,1支加入琼脂斜面培养物菌悬液（或被检菌的营养肉汤培养液）0.5ml，其余2 支作对照管, 1支加入金黄色葡萄球菌菌悬液或营养肉汤培养液0.5ml 作为阳性对照；另一支加入营养肉汤