课件：实验四DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳.ppt

实验四 DNA限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳,EcoR I Restriction Enzyme,识别序列 -GAATT C - - C TTAAG -,实验原理-限制性内切酶及酶切反应,BamH I Restriction Enzyme,识别序列： - GGATC C - - C CTAGG -,Hind III Restriction Enzyme,识别序列： - AAGCT T - - T TCGAA -,每一种限制性内切酶都有特定的反应条件： pH范围： 7.58.0 缓冲液组份: Tris(三羟甲基氨基甲烷）、 NaCl、 MgCl2、 温育温度：37,反应体系： DNA (1ug或更少) 5ul 10 x Buffer 2ul Restriction Enzyme 3ul H2O 10ul Total 20ul 混匀，37度保温30分钟,实验原理-琼脂糖凝胶电泳,电泳是在一个电场的作用下，在琼脂糖支持介质上，能将一个混合物分离成若干条区带（若干个组分）的过程。,琼脂糖凝胶电泳是一种简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。,琼脂糖是一种线性多糖聚合物。将琼脂糖粉末加热到熔点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质。,琼脂糖,琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围,电泳法的优点,凡是能带电的物质，都可以用电泳法分离。 样品用量少。 设备简单。 可在室温进行。 操作简便，费时不多 不同类型的电泳，有不同的用途。 改进或找到更好的支持介质，就有可能大大地提高分辩率。,1、TAE电泳缓冲液 Tris-base 冰醋酸 EDTA 2、琼脂糖凝胶（0.8%） 琼脂糖：0.8g TAE：100ml,试剂,3、溴化乙锭(ethidium bromide，EB),EB染色液工作液浓度：0.010.03mg/ml EB是一种荧光染料，其扁平分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。,4、6 x Loading Dye,组成 0.25% bromophenol blue（深蓝色） 0.4% orange G （黄色） 10mol/L Tirs-HCl (pH7.5), 50mol/L EDTA 使用量 5份DNA样品溶液加1份Blue / 6xLoading Dye,操 作 步 骤,一、酶切反应,反应体系： DNA 5ul 10 x Buffer 2ul Hind III 3ul H2O 10ul Total 20ul 混匀，37度保温30分钟,二、电泳,。,1、电泳前的准备工作 轻轻刷干净电泳制胶的梳子，模板，电泳槽，用蒸馏水洗净晾干，把制胶槽放入模板中。,2、制 胶 (1)每组称取琼脂糖0.24g,倒入三角瓶，再往其中加入 30ml电泳缓冲液，微波炉加热直到琼脂糖溶化。 （2)每组将琼脂糖液冷却到约70,轻轻倒入胶槽，并插 上梳子。凝固约30min. (3)取出梳子，把胶放在电泳槽中，准备电泳。,3、点样和电泳,(1)将酶切产物、自制DNA与6 x Loading Dye混 合，每个样品混合后体积均为24ul。 a.自制DNA 20ul + 4ul Loading Dye b. 酶切产物 20ul +4ul Loading Dye (2)将标准DNA /Hand III 、DNA 、酶切产物、自制 DNA各10ul点入点样孔。 (3)电泳。 (4)EB染色10min。 （注意不要污染实验室环境）,-DNA / Hind III Markers 片段大小（ bp）和电泳带型示意图,点样孔,23130,9416,6557,4361,2322,2027,4、紫外分析仪下看胶,23130,2322,2027,9416,6557,4361,警告,胶染色和观察时一定要带手套！,EB（溴化乙锭） 诱变！,结果记录与分析,绘制电泳图谱,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用,主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！,致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求,感谢您的观看和下载,The user can demonstrate on a projecto