课件：药物分析新方法与新技术-液相色谱联用技术及其应用-张尊建.ppt

1,液相色谱联用技术及其应用,中国药科大学 张 尊 建,药物分析新方法与新技术 之,2,主 要 内 容,第一部分：联用技术概述 第二部分：液质联用技术 第三部分：液核联用技术,3,联用目的 色谱是一种高效的分离手段，可将复杂混合物中的各个组分分离，但其定性能力较差，通常只是利用各组分的保留特性来定性，这在目标物完全未知的情况下是相当困难的。 而随着定性分析和结构分析手段质谱（MS）、核磁共振光谱(NMR)、红外光谱(IR)以及等离子体发射光谱(ICP-AES)等的发展，确定一个纯组分是什么化合物，其结构如何已是比较容易的事。 色谱联用大大增强了色谱分析的定性能力。,第一部分 联用技术概述,难 点：载气(或流动相)的分离，出峰时间监测 关键点：接口技术(分子分离器),4,色谱联用中的“接口”,色谱联用技术就是将一种色谱仪器（GC、HPLC、TLC、SFC、CE）和另一种仪器（MS、NMR、FTIR、AAS、ICP-AES）通过称为 “接口”（Interface）的装置直接联接起来，将通过色谱仪器分离开的各种组分逐一通过接口送到第二种仪器中进行分析。因此接口是色谱联用技术中的关键装置，它要协调前后两种仪器的输出和输入间矛盾。接口的存在既要不影响前一级色谱仪对组分的 分离性能，又要同时满足后一级仪器对样品进样的要求和仪器的工作条件。,5,常用的色谱联用技术,1、气相色谱-质谱联用 气相色谱-质谱（GC-MS）联用仪是开发最早的色谱联用仪器。由于气相分离后的样品呈气态，流动相也是气体，与质谱的进样要求相匹配，最容易将这两种仪器联用。是最早实现商品化的色谱联用仪器。 2、液相色谱-质谱联用 液相色谱-质谱联用（LC-MS）要比GC-MS困难的多，主要是因为液相色谱的流动相是液体，如果让液相色谱的流动相直接进入质谱，则将严重破坏质谱系统的真空，也将干扰被测样品的质谱分析，因此LC-MS联用技术的发展比较慢，出现过各种各样的接口，但直到大气压电离接口的出现，才有了真正成熟的商品化仪器。,6,3、液相色谱-核磁共振波谱联用 核磁共振波谱（NMR）是有机化合物结构分析的强有力工具，特别是对于同分异构体的分析。但实现色谱和NMR的在线联用是当前色谱联用技术中最困难的，也是目前使用最少的色谱联用技术。 主要原因如下： NMR的灵敏度较低，虽然傅立叶变换波谱可以通过信号的累加提高灵敏度，但需要延长信号采集时间，与色谱峰的出峰时间很短矛盾； 为使通过样品的磁场均匀，一般采用将样品管在磁场中以较高速度旋转的方法，这也造成色谱和NMR在线联用的困难； NMR在作质子谱时为避免溶剂干扰，含氢溶剂必须使用氘代溶剂。如用氘代溶剂作流动相，分析成本将大大提高；如不用含氢溶剂，在色谱上又很难实现。在作碳谱时，流动相中的13C也将干扰测定。,7,第二部分 液相色谱-质谱（LC-MS）联用技术,LC-MS的研究开始于20世纪70年代，与GC-MS不同，LC-MS经历了一个更长的实践、研究过程，直到90年代方才出现了被广泛接受的商品接口及成套仪器。 LC-MS在线使用首先要解决的问题仍然是真空的匹配。现有商品仪器的设计均增加了真空泵的抽速并采用了分段、多级抽真空的方法，形成真空梯度以满足接口和质谱正常工作的要求。 除真空匹配外， LC-MS技术的发展可以说就是接口技术的发展。扩大LC-MS应用范围以使热不稳定和强极性化合物在不加衍生化的情况下得以直接分析，并将质谱分析用于生物大分子是LC-MS接口技术发展方向。LC-MS各种“软”离子化接口的开发正迎合了这种要求。,8,1、直接液体导入接口 直接液体导入（DLI）接口出现于20世纪70年代，但这一技术始终停留在实验室使用阶段，没有真正形成商品化仪器。DLI接口是在真空泵的承载范围内，以细小的液流直接导入质谱仪。 2、移动带技术 移动带（MB）技术早在20世纪70年代中期就已有了最初的设计。所谓移动带是在LC柱后增加了一个移动速度可调整的流出物传送带，柱后流出物滴落在传送带上，经红外线加热除去大部分溶剂后进入真空室。 3、热喷雾接口 出现于20世纪80年代中期，是一个能够与液相色谱在线联机使用的“软”离子化接口，得到了比较广泛的应用。,第一节 液相色谱-质谱联用接口的发展,9,4、粒子束接口 粒子束接口（PB）是20世纪80年代出现的另一种应用比较广泛的接口，又称为动量分离器。但由于其离子化手段仍为电子轰击，不是“软”离子化方式，因此不太适合热不稳定化合物的分析。 5、快原子轰击 快原子轰击（FAB）是在最初用于无机化合物表面分析的粒子轰击源（FIB）的基础上发展起来的，是20世纪80年代中期发展的一种新型电离源，是一种“软”离子化技术。 6、激光解析离子化和基质辅助激光解析离子化 基质辅助激光解析（MALDI）离子化技术首创于1988年，是在1975年首次应用的激光解析（LD）离子化技术上发展起来的，目前已得到了广泛的接受和应用。,10,7、电喷雾接口 1984年Fenn等人发表了他们在电喷雾技术方面的研究工作，这一开创性的工作引起了质谱界极大的重视。在其后的十几年中开发出的电喷雾电离及大气压化学电离商品接口是一项非常实用、高效的“软”离子化技术，被人们称为LC-MS技术乃至质谱技术的革命性突破。目前的电喷雾接口已经可安装在四极质谱、磁质谱和飞行时间质谱上。,11,8、多种电喷雾接口技术 电喷雾电离（ESI） 在喷口与毛细管之间施加数千伏特的高电压，此高电压是起关键作用的离子化条件，ESI接口因此得名。 大气压电离（API） 一般意义上指离子化是在常压下完成的；指接口技术时包括所有在大气压下进行的离子化接口。 大气压化学电离（APCI） 用于LC-MS的APCI技术与传统的化学电离接口不同，它并不采用诸如甲烷一类的反应气体，而是借助电晕放电启动一系列气相反应以完成离子化过程，就其原理，它也可被称为放电电离或等离子电离。 nano-ESI 它可用于毛细电泳和微径柱HPLC与质谱联用，原因是它具有很低的工作流速。,12,ESI（电喷雾离子化） 在高静电梯度下，使样品溶液发生静电喷雾，在干燥气流中（近于大气压）形成带电雾滴，随着溶剂的蒸发，通过离子蒸发机制，生成气态离子，以进行质谱分析的过程。,第二节 电喷雾和大气压化学离子化的机制,13,ESI Mode,14,APCI（大气压化学离子化） APCI是在大气压条件下的化学离子化，它由电晕放电针产生的电子轰击空气中主要组分N2、O2、H2O以及溶剂分子得到初级离子N2+、O2+、H2O+和CH3H2O+等。再由这些初级离子与被分析物分子进行电子或质子交换产生出被分析离子。,15,APCI Mode,电晕放电针,16,1、接口的选择 ESI适合于中等极性到强极性的化合物，特别是在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子（蛋白质）。只要有相对强的极性，ESI对小分子的分析常常可以得到满意的结果。,第三节 LC-MS分析条件的选择和优化,APCI不适合可带有多个电荷的大分子，它的优势在于非极性或中等极性小分子的分析。,17,2、正负离子模式的选择 一般的商品仪器中，ESI和APCI接口都有正负离子测定模式可供选择。,正负离子模式选择的原则,18,3、流动相和流量的选择,19,药物代谢动力学主要研究药物在体内的动态变化规律，阐明药物的吸收、分布、代谢和排泄过程及特点 是新药开发研究中不可缺少的环节 其基础之一是体内药物的有效测定,第四节 LC-MS在药代动力学研究中的应用,20,非苯二氮卓类药物扎来普隆的LC-MS分析,扎来普隆为非苯二氮卓类衍生物，具有镇静催眠、肌肉松弛、抗焦虑和抗惊厥作用,是一种起效快速的新型安眠药。,仪器： Shimadzu LCMS-2010A 液相色谱/质谱联用系统 色谱柱：Shimadzu Shim-pack VP- ODS C18（250 mm2.0 mm ID, 5 m）,21,Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is the most powerful technique for the structural elucidation of unknown compounds. This is the reason why the hyphenation between chromatographic seperation technique together with NMR spectroscopy is becoming increasingly popular. Both LC(1899) and NMR(1945) have been and still routinely used in mixture analysis.,第三部分 液核（LC/NMR）联用技术,Background of instruments development,22,The first on-line LC-NMR experiments were performed in the late 1970s by Watanabe and Niki who demonstrated stopped-flow measurements of a mixture of known compounds. A successful and practical LC-NMR coupling has been achieved only in the last decade. Currently, there are several LC-NMR systems available, and data acquisition can be achieved using various modes depending on the status of the sample during measurement.,23,Coupling technology of LC-NMR, On-flow LC-NMR LC-NMR under static conditions： Direct stop-flow Loop storage/loop transfer LC-SPE-NMR LC-NMR-MS Cryogenic technology in LC-NMR,24,On-flow LC-NMR(continuous flow), Here,the outlet of the chromatographic system is connected to an NMR detection cell. The NMR spectra are acquired continuously while the sample is flowing through the detection cell. The chromatography and NMR systems perform completely independent by of each other. The only necessary link is the liquid connection between the column and the NMR detection cell. The NMR spectrometer can act as a detector in the chromatographic system, so that even a conventional LC detector in the chromatographic system is not necessary.,25,LC-NMR under static conditions Direct stop-flow, In this mode, the eluent is directly flowing from the chromatographic system into the NMR probe. As only selected peaks are measured in the NMR spectrometer. The separation is monitored in parallel with an LC detector (typically a UV detector). The peak is selected from the chromatogram recorded by the LC detector. The separation is interrupted after a certain time delay which is necessary to allow the peak to move from the LC detector to the NMR detection cell. The sample remain static in the flow cell and the condition will remain stable during the whole NMR experiment. The parameters can be precisely adapted for the measurement of each individual sample. Advantage: Good NMR signal, LC-2D NMR. Disadvantage: time-consuming and peak broadening. a precise TD value has to be tested. memory effect.,26,LC-NMR under static conditions Loop storage/loop transfer, In this case, the eluent is directly flowing from the chromatographic system into a storage device. As only selected peaks are measured in the NMR system. The separation is monitored in parallel with an LC detector (typically a UV detector). The peak is selected from the chromatogram recorded by the LC detector, and the storage loop is isolated after a certain time delay which is necessary to allow the peak to move from the LC detector into the loop. At a later stage, after the separation is finished, the loop contents are transferred in arbitrary order into the NMR spectrometer. Now, all kinds of 1D and 2D NMR measurements can be carried out.,27,LC-SPE-NMR （Combined use of HPLC-MS and HPLC-NMR together with solid-phase extraction）, Be utilized to solve the problem of low concentration, such as：trace analysis. On-line solid-phase extraction(SPE) is often needed to concentrate a sample prior to HPLC-NMR analysis. Often Combined with Cryogenic technology.,28,Cryogenic technology in LC-NMR, Today, cryomagnets with extreme high magnetic field homogeneity are used, employing the pulse Fourier transform technique. With 600-900 MHz NMR spectrometers applying modern highly sophisticated two-