课件：DNA--重组-酶切和连接.ppt

Q&A,关于质粒提取结果的分析,预实验结果,载体 （3.65kb）,1 2 3,PET Blue质粒DNA的琼脂糖电泳（1%） Lane1：sample 1 Lane2：sample 2 Lane3：sample 3,一条带,杂带,预实验结果,PET Blue质粒DNA的琼脂糖电泳（1%） Lane1：sample 1 Lane2：sample 2 Lane3：sample 3,两条带,三条带,DNA分子的大小 琼脂糖浓度 DNA分子构象 染色剂的量 电压 缓冲液的组成 缓冲液离子强度 等等 分子克隆上册,第五章,一条带,1 2 3,我们的结果,PET Blue质粒DNA的琼脂糖电泳（1%） Lane1：Marker； Lane2：sample 1; Lane3：sample 2; Lane4：sample 3,1 2,15000bp,10000bp,7500bp,5000bp,2500bp,1000bp,250bp,3 4,我们的结果,质优量少，成功率低,质优量足,卫星菌落？,我们的结果,?电泳行为异常?,我们的结果,可用,电泳：尽量减少上样时间，减少扩散； 样品尽量均匀分布于胶孔中； 尽量远离边缘泳道,Q&A,关于实验中的安全问题 关于酚-氯仿-异戊醇 分层问题：下层 作用问题：酚变性蛋白 氯仿去除脂类，除酚 异戊醇消泡，减少表面张力剪切 关于酚：下层； 氧化判断,基因重组 酶切和连接,基因的克隆与表达专题之三,剪切,pETBlue-2 ATG GCG ATA TCC CGG GAG CTC GTG GAT CCG AAT 引物1： 5GTCGCGGATCCGATGTCACGGCCGAGAC3 BamH 引物2： 5GCGACAAGCTTTATTTCAGCCCCAGAGC3 Hind,5pApCpGoH pApApTpTpCpGpT3 3TpGpCpTpTpApAp oHG pCpAp5 5pApCpGpApApTpTpCpGpT3 3TpGpCpTpTpApApGpCpAp5,Mg2+ ATP T4DNA连接酶,连接,酶切：370C，水浴酶切3小时(封口膜封口） 酶切产物的纯化和盒回收： 直接进行液体回收： 每100uL溶液加入500uL溶胶液，其余的操作步骤同前。 向柱子的正中央 共加20uL洗脱buffer，其余步骤同前。,实验操作酶切,每人做一至两份,胶回收原理,硅基质材料： 小片段双链DNA高盐环境与其吸附 低盐环境与其解离,每100uL溶液加入500uL溶胶液,混匀。 将液体转移至吸附柱，12000rpm离心30秒，去除废液 漂洗:向吸附柱的正中央加入500uL漂洗液，12000rpm离心30秒，去除废液。重复一次。 空柱12000rpm离心2min，以彻底去除废液 将吸附柱置于一新的干净无菌的1.5mLEP管中，向吸附柱的正中央加15uL无菌水，室温放置5分钟。12000rpm离心30秒，以洗脱DNA。 再次向柱子的正中央加5uL无菌水，室温放置5分钟；12000rpm离心2分钟。合并回收液。 SYBR检测回收产物,避免乙醇对酶促反应的影响,1%琼脂糖凝胶 25mL (用1xTAE配) 1uL GoldView 样品：酶切DNA 4uL + 0.5uL 10xloading 质粒对照：未酶切质粒DNA 2uL + 0.5uL 10xloading 分子量Marker： 5uL 80伏恒压电泳，结果凝胶成像分析 注意： Marker上5uL时大概的量是50ng/条带 上样精准 上样顺序（对照）,实验操作酶切电泳分析*,P V0 V1 V1 M,2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp,控制载体和目的基因的比例为1：31:10 140C连接过夜 明天早晨？点各组派代表收样品 200C保存，用于转化受体细胞,实验操作连接,连接产物转化克隆菌株,下次实验的简介与准备,1. 0.1mol/L的CaCl2 100mL两组，高压灭菌 2. LB液体培养基 90mL/组，高压灭菌 胰蛋白胨（typtone) 0.9g 酵母提取物（yeast extract) 0.45g NaCl 0.9g 先加90mL水溶解后， 5mol/L NaOH调pH值（18L）分装：250mL锥形瓶，40mL2瓶； 15mL大试管, 5mL2管。,试剂配制,1. 试剂 2. 小指管： 1.5 mL 50个 3. 枪头： 5 mL 8支 4. 50 mL离心管： 4个 5. 直径9cm的平皿： 8套 6. 其它枪头：各1盒,周三下午接菌预培养!（两人一管，抗生素）,灭菌,1. X-gal 2. 互补 3. 感受态细胞制备 4. NovaBlue菌株 5. Tuner(DE2)placI菌株,预习,谢谢大家！,NovaBlue：来源于大肠杆菌K12 基因型 endA1 hsdR17 (rK-mK+) supE44 thi-1 gyrA96 relA1 lac recA1/FproA+B+ lacIqZM15 Tn10 (Tetr),endA：该基因表达非特异性核酸内切酶，它使所有的DNA双链解开。endA基因的突变将使插入的外源DNA更加稳定，提取的质粒纯度更高。 hsdR：该基因表达型限制酶，对外源的各种DNA有严格的限制。hsdR基因的变异导致菌株细胞内的型限制酶活性缺失，这对外源基因的导入及质粒的转化是有利的。,hsdR17(rk12-mk12+)：表示R17 的变异而导致K菌株来源的hsdR的功能丧失。 recA1： recA为基因重组相关的基因，表达ATP依赖型DNA重组酶。该基因突变（recA1）导致同源或异源DNA重组不能进行，保持插入DNA的稳定性，对DNA的转化是有利的。 supE44 (Suppressor) ： 该基因表达的阻遏蛋白与终止密码子UAG结合，使蛋白质合成终止。,Thi-1： 该基因表达与硫氨素合成有关的蛋白和酶，thi 的变异使硫氨素的生物合成不能进行，最小培养基中必须添加硫氨素（VB1），细胞才能正常生长。 gyrA96(Gyrase): gyrA基因表达DNA促旋酶A亚基。 relA1：是松弛调节基因，对RNA的合成具有调节抑制机制。relA基因的突变对目的基因的转录有利。 proAB：表达谷氨酸合成有关的酶。,lacIq： lac操纵子的调节基因，编码阻遏蛋白。Lac基因发生变异而使其大量地表达阻遏蛋白，从而使lac操纵基因几乎完全被抑制。 lacZM15： lacZ 的M15是表达半乳糖苷酶片端的一段基因，当M15缺失（M15）时lacZ基因只能表达片端，半乳糖苷酶没有活性。 Tn10（Transposon）： Tn10是载有四环素抗性基因的转座子。,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用,主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！,致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方