课件：质粒DNA的提取与酶切鉴定.ppt

实验四 质粒DNA的提取与酶切鉴定,一. 实验目的和要求 1、了解质粒DNA的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌细胞中分离、提取质粒DNA的方法； 2、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法； 通过本实验了解限制性内切酶在分子生物学研究中的意义与作用。,二.实验原理 1、碱裂解法小量制备质粒DNA：碱裂解法是基于线性大分子染色体DNA与小分子环形质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的的，在pH12.012.6的碱性环境中，线型染色体DNA和环型质粒DNA氢键会发生断裂，双链解开而变性，但质粒DNA由于其闭合环型结构，氢键仅发生部分断裂，而且其互补链不完全分离；当将pH值调节到中性并在高盐浓度下，已分开的染色体DNA互补链不能复性而交联形成不溶的网状结构，通过离心，大部分染色体DNA、不稳定的大分子RNA和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合环状的质粒DNA在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶液中，离心后上清中便含有所需要的质粒DNA。,2、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为、III型三大类，类和III类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。类限制性内切酶结合于特定识别位点，但却随机地切割回转到被结合处的DNA。类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故类和限制酶在基因工程中基本不用，II类酶在分子克隆中使用广泛。,其基本特点如下： (1)、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如EcoR I识别与切割序列为 5GAATTC3 3CTTAAG5 (2)、识别的核苷酸数目大多数为46个，少数识别813个； (3)、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大多数酶产生的是具有凸出的粘性末端：,(4)、有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列，甚至切割的位点也相同，称为同裂酶或异源同工酶，如Hpa II与Msp I；有的识别位点不同，但对DNA切割后可产生相同的粘性末端，称为同尾酶，如BamH I与Bgl II。,三实验材料与设备： 超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝胶成像仪、冰箱、制冰机等； 1.5mL 与0.5mL Eppendorf 管、Tip头 、烧杯、量筒,试剂： LB培养基 氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mgmL； 溶液I: 50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA (pH8.0)， 25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)； 溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS (现配现用)； 溶液III: 乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)( 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml 冰醋酸，28.5mL H2O)； RNase A： 10mg/ml； TE缓冲液: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA，pH8.0；,5TBE缓冲液：0.45mol/L Tris硼酸，0.01 mol/L EDTA, pH 8.0； 10Loading buffer：1% SDS, 0.05%溴酚兰，50的甘油； 无水乙醇；70乙醇； 标准分子量片段； 核酸内切酶 EcoR I (TaKaRa)； EcoR I酶解缓冲液(10 buffer H)； 琼脂糖； 溴化乙啶（EB）染色液(10mg/ml)。,四、碱裂解法小量制备质粒DNA 1、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培养基中，37震荡培养1216小时； 2、将1.5mL菌液加入Ep离心管中，12000 g离心30 Sec，弃上清液，在吸水纸上扣干； 离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮 3、加入100L预冷的溶液I ，于涡旋振荡器上振荡悬浮细菌细胞，尽量使细胞分散； 溶液I中的葡萄糖的作用是增大让一让的粘度，减少提取过程中的机械剪切力，防止染色体DNA 的断裂；EDTA的作用是与二价离子（Ca2）结合，降低DNase对DNA的降解,4、加入200L新配制的溶液II, 盖紧管口,快速颠倒离心管, 以混匀内容物,冰上放置35min; 溶液II中的NaOH与SDS可裂解细胞，使DNA变性以及SDS使蛋白变性并形成交联的网状结构 5、加入150l溶液III, 加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置23min； 溶液III为低pH的醋酸钾缓冲液，中和NaOH，以便使部分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体DNA不能正确复性,6、12000 g离心6 min，将上清移入另一干净的Ep管中； 7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇, 振荡混匀，室温放置2min. 8、12000g离心10min，弃上清液，再用70的乙醇洗涤一次， 12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸上扣干，然后在中空浓缩系统上干燥质粒； 9、加入40L含50 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约8min)，存于20或直接用于酶切。,质粒图谱:,五、 提取质粒的酶切鉴定与琼脂糖凝胶电泳 1、在1.5mL Ep管中依次加入下列溶液于1.5ml离心管中 提取质粒DNA 4.0 L 10 buffer H 1.0 l EcoR I 1.0 l （2.0 U） dd H2O 4.0 L 10 L 1U: 1单位酶通常定义为，在建议缓冲液及温度下， 在20 L 反应液中反应1h，使1 g DNA完全消化所需的酶量. 2、轻轻混匀, 4000g离心10秒 ，置于37水浴中酶解2-3h。 3、酶解完成后，电泳检测酶切结果。,六、 实验结果报告,1、质粒浓度的计算（紫外分光光度计法） 紫外分光光度法测定核酸含量 双链DNA含量=OD260nm样品稀释倍数50ugml=ug/m1样品 2、质粒提取与酶切鉴定电泳结果，贴上打印实验照片并标明照片上各DNA条带的含义。,七、思考题,1、根据DNA限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为几种类型？其中II类限制性内切酶有何特性？ 2、在用碱裂解法小量制备质粒过程中I液、II液与III液的作用是什么？,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 资料仅供参考，实际情况实际分析,主要经营：课件设计，文档制作，网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！ 致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造