染色体重组材料创制及外源基因在小麦背景中表达研究

分分 类类 号：号：S512.1 单位代码：单位代码：10183 研究生学号：研究生学号： 密密 级：公开级：公开 吉 林 大 学 博士学位论文 小-大麦 2H 染色体重组材料创制及外源基因 在小麦背景中表达研究 Development of wheat-barley chromosome 2H recombination lines and research on expression of alien genes in wheat background 作者姓名：作者姓名： 邹宏达邹宏达 专专 业：业： 植物学植物学 研究方向：研究方向： 植物种质资源与利用植物种质资源与利用 指导教师：指导教师： 原亚萍原亚萍 教授教授 培养单位：培养单位： 植物科学学院植物科学学院 2012 年年 12 月月 小-大麦 2H 染色体重组材料创制及外源基因 在小麦背景中表达研究 Development of wheat-barley chromosome 2H recombination lines and research on expression of alien genes in wheat background 作者姓名：邹宏达 专业名称：植物学 指导教师：原亚萍 教授 学位类别：理学博士 论文答辩日期： 年 月 日 授予学位日期： 年 月 日 答辩委员会主席： 论 文 评 阅 人： 本研究由国家自然科学基金项目本研究由国家自然科学基金项目()() 资助资助 This research was supported by the National Basic Research of China (NO.). 未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文 书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文 的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出 租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使 用不在此限） 。否则，应承担侵权的法律责任。 吉林大学博士学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对 本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标 明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 日期： 年 月 日 中国优秀博硕士学位论文全文数据库投稿声明 研究生院： 本人同意中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程的 内容，愿意将本人的学位论文委托研究生院向中国学术期刊（光盘 版）电子杂志社的中国优秀博硕士学位论文全文数据库投稿， 希望中国优秀博硕士学位论文全文数据库给予出版，并同意在 中国博硕士学位论文评价数据库和 CNKI 系列数据库中使用， 同意按章程规定享受相关权益。 论文级别：硕士 博士 学科专业：植物学 论文题目：小-大麦 2H 染色体重组材料创制及外源基因在小麦背景 中表达研究 作者签名： 指导教师签名： 年 月 日 作者联系地址（邮编）： 作者联系电话： I 摘 要 小小- -大麦大麦 2H2H 染色体重组材料创制及外源基因在小麦背景中表达研究染色体重组材料创制及外源基因在小麦背景中表达研究 小麦（Triticum aestivum L.，2n = 6 = 42）和大麦（Hordeum vulgare L.，2n = 2 = 14)是 世界上两大重要的麦类作物，通过小麦和大麦的远缘杂交，可以将大麦的优良基因及其相 应性状导入小麦，如早熟、耐生物和非生物胁迫及各种品质性状。小麦成熟期穗发芽是一 种世界性自然灾害，穗发芽时小麦 -淀粉酶活性提高，对胚乳中淀粉分解能力增强，不仅 影响小麦产量，而且还会影响小麦的营养品质和加工品质。位于大麦 2H 染色体长臂上的 Isa 基因所编码的大麦 -淀粉酶抑制蛋白 BASI（bifunctional -amylase/subtilisin inhibitor） ， 可以通过与小麦 -淀粉酶相结合而抑制其活性，从而降低小麦穗发芽的危害，提升小麦品 质。 本研究通过郑麦 9023，CB037，中麦 16 等小麦品种与小-大麦 2H 染色体异代换系 2H(2A)及 2H(2B)的杂种幼胚组织培养，经愈伤组织诱导、继代、分化的途径最终获得 522 株结实的 SC1代再生植株。以大麦 Betzes、小麦 CS、小-大麦 2H 染色体异附加系、一整套 小-大麦 2H 染色体异代换系 2H(2A)、2H(2B)和 2H(2D)为材料共筛选出 10 对分别位大麦 2H 染色体短臂和长臂的大麦 2H 染色体特异 SSR 分子标记。通过大麦第二部分同源群特异 SSR 分子标记，对组培 SC1代再生植株及其自交后代 SC2-5代植株进行逐代筛选，以追踪和 鉴定大麦 2H 染色体。通过以大麦 Betzes 基因组 DNA 为探针、小麦 CS 基因组 DNA 为封 阻的基因组原位杂交对部分 SC4及 SC5植株进行进一步验证，最终获得了携带有大麦 2HL 染色体的杂合易位、纯合易位、单端体、双端体及单等臂体遗传材料。经大麦 Isa 基因特 异引物进行 PCR 验证，以上这些材料均携带 Isa 基因。对小-大麦 2HL 染色体杂合易位系 32-4-9，32-4-18 及纯合易位系 32-4-11 花粉母细胞减数分裂 I 中期的染色体构型进行检测， 表明杂合易位系和纯合易位系染色体配对正常，细胞学上遗传稳定。 在将外源种质转移至小麦遗传背景的过程中，会引起小麦基因组结构及基因表达的广 泛遗传变异。为了了解由大麦 2H 染色体导入而引起的小麦基因组结构的变异，采用荧光 AFLP 对大麦 Betzes，小麦 CS, 小-大麦 2H 异附加系，小-大麦 2H 异代换系 2H(2A)、 2H(2B)、2H(2D)这一整套材料进行分析。64 对引物组合在大麦中获得了 3157 个条带，在 其它材料中获得了 4736 个条带。AFLP 扩增类型表明，附加系中检测到了消减和激活位点， 而代换系基因组结构几乎无变化。同时还检测到了多条大麦 2H 染色体及小麦 2A、2B、2D 染色体特异的 AFLP 片段，经回收测序后，将 AFLP 分子标记转换成 STS 分 子标记并进行验证，共获得 2 条大麦 2H 染色体特异的 AFLP-STS 分子标记，小麦 2A、2B、2D 染色体特异的 AFLP-STS 分子标记各 1 条。 为了了解由大麦 2H 染色体导入而引起的小麦基因组的表观遗传学变异，在荧光 II AFLP 检测的基础上构建了荧光 MSAP 检测体系，对大麦 Betzes，小麦 CS, 小-大麦 2H 异 附加系，小-大麦 2H 异代换系 2H(2A)、2H(2B)、2H(2D)这一整套材料的基因组甲基化模 式进行分析。MSAP 结果表明，大麦 2H 染色体导入引起了小麦基因组的甲基化变异，同 时大麦 2H 染色体本身也检测到了甲基化的升高。 为了了解由大麦 2H 染色体导入所引起的基因表达差异，通过荧光 cDNA-AFLP 对大 麦 Betzes，小麦 CS, 小-大麦 2H 异附加系，小-大麦 2H 异代换系 2H(2A)、2H(2B)、2H(2D)这 一整套材料进行了基因表达差异分析，分离和克隆了大量差异表达基因，并初步确定了大 麦 2H 染色体在小麦基因背景中的表达模式。 通过 iTRAQ 技术来了解由大麦 2H 染色体导入所引起的蛋白表达差异，尝试对以上材 料进行差异蛋白质组学分析，目前为止，共鉴定出 589 个蛋白。 关键词：关键词： 小麦，大麦，2H 染色体，易位系，分子标记，基因表达 III Abstract Development of wheat-barley chromosome 2H recombination lines and research on expression patterns of alien genes in wheat genetic background Wheat (Triticum aestivum L., 2n = 6 = 42) and barley (Hordeum vulgare L., 2n = 2 = 14) are two of the most important cereal crops worldwide. The hybridization of wheat and barley makes it possible to transfer desirable genes and traits, such as earliness, tolerance to biotic and abiotic stresses, and various nutritional parameters, from barley to wheat.The wheat pre-harvest sprouting is a worldwide natural disaster. In the course of high activity of -amylase, pre-harvest sprouting can not only result in a great decrease in wheat yield, but also dramatically degrade the nutritional and processing quality of the seeds. The bifunctional -amylase/subtilisin inhibitor (BASI) encoded by the Isa gene on barley chromosome 2HL could inhibit wheat -amylase activity by reducing pre-harvest sprouting and improving the quality of wheat. Regenerated plants were derived from immature embryo culture of hybrids of common wheat varieties Zhengmai 9023, CB037 and Zhongmai 16 with the wheat-barley 2H alien substituion lines 2H(2A) and 2H(2B) after callus induction, subculture and differentiation. 10 SSR molecular markers specific to barley chromosome 2H located on short arm and long arm were selected from barley Betzes, wheat CS, wheat-barley 2H addition line, wheat-barley 2H substitution line 2H(A), 2H(2B) and 2H(2D). The presence of barley 2H chromatin was detected in regenerated plants (SC1) and their selfed progenies (SC2-5) using homoeologous group 2 SSR markers from barley, and further identified in selected SC4 and SC5 lines using genomic in situ hybridization with barley genomic DNA as probe and CS genomic DNA for blocking. The Isa gene from the identified SC4 and SC5 lines was also amplified using Isa specific primers. We identified wheat- barley 2HL chromosome heterozygous translocation lines, a homozygous translocation lines, monotelosomic lines, ditelosomic lines, and an isochromosome line carring the Isa gene. Metaphase I pairing of line 32-4-9, line 32-4-18, line 32-4-11 indicated that both the wheat-barley 2HL chromosome heterozygous translocation line and homozygous translocation line should regularly disjoin and be stable in cytology. During the process of alien germplasm introduced into wheat genetic backgroud, extensive genetic variations of genome structure and gene expression could be induced in wheat. To understand genetic changes associated with introduction of barely chromosome 2H into wheat genome, a set of barley Betzes, wheat CS, wheat-barley 2H addition line, wheat-barley 2H substitution line 2H(A), 2H(2B) and 2H(2D) were analyzed by fluorescence AFLP. Using 64 primer combinations, 3157 bands were obtained in barley and 4736 bands in other materials. AFLP amplification patterns indicated that elimination bands and novel bands were detected in addition line, but on genome variation were dectected in substitution lines. Several AFLP bands specific to chromosome 2H, 2A, 2B, 2D were recoveried and sequenced respectively, for STS IV primers design. Finally, 2 AFLP-STS molecular markers specific to barley chromosome 2H and 1 AFLP-STS molecular markers specific to each one of wheat chromosome 2A, 2B, 2D were established. To understand epigenetic variations associated with introduction of barely chromosome 2H into wheat genome, fluorescence MSAP detection system was constructed based on fluorescence AFLP, for the methylation patterns detection of a set of barley Betzes, wheat CS, wheat-barley 2H addition line, wheat-barley 2H substitution line 2H(A), 2H(2B) and 2H(2D) . The results that methylation variations were detected in wheat and the methylation extent increased in barley chromosome 2H. To understand gene expression characteristics associated with introduction of barely chromosome 2H, we used the fluorescence cDNA-AFLP to analyse the different expression of a set of barley Betzes, wheat CS, wheat-barley 2H addition line, wheat-barley 2H substitution line 2H(A), 2H(2B) and 2H(2D) . A large number of differentially expressed genes were isolated and express patterns of barley 2H chromosome were confirmed In order to understand the protein expression differences associated with introduction of barely chromosome 2H, iTRAQ technology was used for differential proteomics analysis for above materials, and a total of 589 proteins were identified. Key words: Wheat, Barley, chromosome 2H, translocation line, molecular markers, gene expression I 目 录 英文缩写词英文缩写词 I 第第 1 章章 文献综述文献综述1 1.1 小麦穗发芽 .1 1.1.1 小麦穗发芽的危害.1 1.1.2 影响小麦穗发芽的因素.2 1.2 大麦 -淀粉酶抑制蛋白.5 1.2.1 大麦 -淀粉酶抑制蛋白结构特点和功能 5 1.2.2 大麦 -淀粉酶抑制蛋白的时空表达及影响因素 5 1.2.3 大麦 -淀粉酶抑制蛋白的作用机制 6 1.2.4 大麦 -淀粉酶抑制蛋白的应用前景 7 1.3 大麦有益基因向普通小麦的导入 .7 1.4 小麦背景中大麦染色体的鉴定 .12 1.4.1 基因组水平.12 1.4.2 表观遗传学水平.15 1.4.3 转录水平.17 1.4.4 蛋白质水平.19 1.5 研究目的和意义 .22 第第 2 章章 小小-大麦大麦 2H 染色体重组材料创制与鉴定染色体重组材料创制与鉴定 .23 2.1 实验材料 .23 2.2 实验方法 .23 2.2.1 杂交组合配制.23 2.2.2 幼胚组织培养.23 2.2.3 基因组 DNA 提取、纯化与浓度测定（小量提取）24 2.2.4 SSR 分子标记.25 2.2.5 基因组原位杂交.29 2.2.6 Isa 基因特异分子标记.33 2.2.7 花粉母细胞染色体构型.33 II 2.3 结果与分析 .34 2.3.1 小-大麦重组材料创制34 2.3.2 大麦 2H 染色体特异 SSR 分子标记.34 2.3.3 SSR 分子标记鉴定筛选筛选重组材料.35 2.3.4 基因组原位杂交.38 2.3.5 Isa 基因特异分子标记分析.40 2.3.6 花粉母细胞减数分裂 I 中期染色体构型分析40 2.3.7 易位系农艺性状.41 2.4 讨论 .42 2.4.1 组织培养与易位系选育.42 2.4.2 SSR 分子标记和基因组原位杂交相结合鉴定筛选易位系.43 2.4.3 小-大麦易位系的利用价值44 第第 3 章章 小麦遗传背景中大麦小麦遗传背景中大麦 2H 染色体基因组结构分析染色体基因组结构分析.45 3.1 实验材料 .45 3.2 实验方法 .45 3.2.1 基因组 DNA 提取、纯化与浓度测定（大量提取）45 3.2.2 AFLP 分析（荧光标记检测）46 3.2.3 AFLP 分析（银染检测）50 3.2.4 差异片段回收、克隆.52 3.2.5 差异片段序列分析及同源性比较.57 3.2.6 AFLP-STS 分子标记的设计与验证57 3.3 结果与分析 .58 3.3.1 AFLP 荧光检测58 3.3.2 AFLP 银染检测60 3.3.3 AFLP 扩增类型61 3.3.4 AFLP-STS 分子标记的设计和验证63 3.4 讨论 .65 3.4.1 AFLP 荧光检测同 AFLP 银染检测比较 65 3.4.2 大麦 2H 染色体导入小麦背景中后的基因组结构变异66 III 3.4.3 AFLP 分子标记转化 STS 分子标记.68 第第 4 章章 小麦遗传背景中大麦小麦遗传背景中大麦 2H 染色体基因组甲基化分析染色体基因组甲基化分析.75 4.1 实验材料 .75 4.2 实验方法 .75 4.2.1 基因组 DNA 提取、纯化与浓度测定（大量提取）75 4.2.2 MSAP 分析（荧光标记检测）.75 4.2.3 MSAP 分析（非荧光标记检测）.78 4.2.4 差异片段回收、克隆.80 4.2.5 差异片段序列分析及同源性比较.80 4.3 结果与分析 .80 4.3.1 MSAP 荧光检测.80 4.3.2 MSAP 扩增类型.82 4.3.3 MSAP 差异片段回收、测序与同源性分析.84 4.4 讨论 .86 第第 5 章章 小麦遗传背景中大麦小麦遗传背景中大麦 2H 染色体基因组表达分析染色体基因组表达分析.91 5.1 实验材料 .91 5.2 实验方法 .91 5.2.1 实验材料处理.91 5.2.2 总 RNA 提取 91 5.2.3 cDNA 第一链合成 .92 5.2.4 cDNA 第二条链的合成 .93 5.2.5 cDNA 第二条链的纯化 .93 5.2.6 cDNA-AFLP 荧光检测 94 5.2.7 差异片段序列分析及同源性比较.94 5.3 结果与分析 .95 5.3.1 cDNA-AFLP 荧光检测 95 5.3.2 cDNA-AFLP 差异片段回收与测序 98 5.4 讨论 .100 第第 6 章章 小麦遗传背景中大麦小麦遗传背景中大麦 2H 染色体蛋白质组分析染色体蛋白质组分析.115 IV 6.1 实验材料 .115 6.2 实验方法 .115 6.2.1 品质测定.115 6.2.2 籽粒胚乳超微结构观察.115 6.2.3 2D-PAGE 分析.115 6.2.4 iTRAQ 分析120 6.3 结果与讨论 .123 6.3.1 品质测定.123 6.3.2 籽粒胚乳超微结构观察.123 6.3.3 籽粒种子总蛋白双向电泳分析.124 6.3.4 籽粒总蛋白 iTRAQ 分析.126 第第 7 章章 结论结论131 参考文献参考文献133 攻读学位期间发表的学术论文攻读学位期间发表的学术论文151 致致 谢谢153 I 英文缩写词 英文缩写英文全称中文全称及注释 ABA AFLP Amp Abscisic acid Amplified fragment length polymorphism Aminobenzyl penicillin 脱落酸 扩增片段长度多态性 氨苄青霉素 BASI BLAST Barley -amylase/subtilisin inhibitor Basic Local Alignment Search Tool 大麦 -淀粉酶抑制蛋白 基本局部比对搜索工具 DDT EB Dithiothreito Ethidium bromide 二硫苏糖醇 溴化乙锭 EDTAEthylenediamine tetraacetic acid乙二胺四乙酸 ELISA GA Enzyme linked immunoserbent assy Gibberellin 酶联免疫吸附 赤霉素 IPTGIsopropyl -D-thiogalactoside异丙基硫代半乳糖苷 LMLater mature -amylase迟熟 -淀粉酶 MSAPMethylation sensitive amplification甲基化敏感扩增多态性 PAGEPolyacrylamide Gel Electrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳 PHSPre-harvest Sprouting穗发芽 PMSFPhenylmethanesulfonyl fluoride苯甲基磺酰氟 PVPPCrossl inking polyvinylpyrrolidone交联聚乙烯吡咯烷酮 PCRPolymerase chain reaction聚合酶链式反应 SDSSodium dodecyl sulfate十二烷基磺酸钠 SNPsSingle nucleotide polymorphisms单核苷酸多态性 SSRSimple Sequence Repeat简单重复序列 STSSequence tagged site序列标签位点 TCA TDF TEAB Trichloroacetic acid Transcripit derived fragment Triethylammonium bicarbonate 三氯乙酸 转录衍生片段 三乙基碳酸氢铵 第 1 章 文献综述 1 第 1 章 文献综述 穗发芽是一种世界范围的自然灾害，包括小麦、大麦、黑麦、小黑麦、玉米、水稻和 高粱等在内的诸多谷物均会受其影响。穗发芽（Pre-harvest Sprouting，简称 PHS） ，通常是 指谷物临近收获期时，由于持续降雨而处在高湿度环境下所导致的谷物籽粒在穗上萌动乃 至发芽的现象1。谷物穗发芽的明显表征与谷物籽粒正常萌发类似，表现为籽粒肿胀，胚 变色，种皮开裂，根、芽露出等。穗发芽不仅会降低谷物的产量，还会严重影响到谷物品 质、加工品质、储存质量及播种质量等2,3，给农民、种子经营者、谷物加工等相关从业人 员和相关行业带来严重的经济损失和不便。随着穗发芽危害程度的增加，逐渐引起了国内 外众多研究学者的重视与关注，自 1975 年举办了第一届国际谷物穗发芽研讨会 （International Symposium on Pre-Harvest Sprouting in Cereals）以来，截止至 2011 年 8 月， 已经举办了 12 次国际会议来交流穗发芽研究进展并商议、探讨如何解决并降低穗发芽所带 来的损失。 1.1 小麦穗发芽小麦穗发芽 1.1.1 小麦穗发芽的危害小麦穗发芽的危害 小麦穗发芽危害在世界范围内于小麦收获季节易降雨地区十分的普遍。据报道，几个 主要的小麦生产区域，如南北美洲地区的美国、加拿大、巴西，澳洲的澳大利亚、新西兰， 亚洲的印度、日本等国的部分地区及欧洲全境，尤其是英国、瑞典、波兰等国均有发生4。 据美国农业部网站发表的软质冬小麦品质的遗传和生化 (Genetic and biochemical basis of soft winter wheat quality) 基础项目的会议摘要显示，全世界范围内，每 10 年中有 3-4 年均 会发生不同程度的小麦穗发芽危害，并且仍会持续发生5。在穗发芽比较严重的小麦出口 大国加拿大，包括部分地区穗发芽率高达 80% 的 1989 年在内6，平均每年由小麦穗发芽 所造成的各项经济损失高达 1 亿美元7。在我国，东北春麦区、西北春麦区、黄淮冬麦区、 北部冬麦区、长江中下游地区以及西南冬麦区这几个小麦主要产区，在不同地区、不同年 份，均有不同程度的小麦穗发芽危害发生，其中东北春麦区、西南冬麦区和长江中下游地 区为穗发芽常发地区，但由于穗发芽的出现并无规律且难以预测，所以过去我国对穗发芽 的危害鲜有报道4。据报道 1987 年收麦季节的连续阴雨，导致黄淮麦区的陕西关中发生严 吉林大学博士学位论文 2 重的穗发芽8。1998 年总后嫩江农场达 30 万亩小麦全部发生穗发芽，造成了严重损失9。 2009 年上旬，由于江苏淮北及苏中地区麦收季节遭遇连续阴雨，当地的白皮小麦均发生了 不同程度的穗发芽10。2008-2009 年，我国北部麦区以及湖北、河南、江苏、安徽、山东 等多个省份种植的小麦均发生了不同程度的穗发芽11,12。本文作者自 2007 年于小麦实验田 （吉林省长春市吉林大学农学部植物科学学院网室）种植和筛选抗穗发芽的小-大麦 2H 染 色体重组材料以来，连续几年的小麦收获季（大约在每年的 7 月中旬）均有大量降水，小- 大麦 2H 染色体重组材料的农艺亲本郑麦 9023、CB037 及其它穗发芽敏感的遗传材料均发 生了不同程度的穗发芽，两个农艺亲本，均为白皮，穗发芽敏感的品种，其穗发芽情况见 图 1。 图图 1.1 小麦穗发芽小麦穗发芽 Figure 1.1 Wheat pre-harvest sprouting 小麦品种郑麦 9023；小麦品种 CB037；摄于 2010 年 7 月 18 日 小麦穗发芽可以引起小麦籽粒的一系列生理变化，由于水解酶的活性增强和植物激素 的含量的变化，籽粒的总蛋白、贮存物质和氨基酸的组成都会发生剧烈变化，从而会急剧 降低小麦产量，而且还会显著影响小麦的营养品质和加工品质13。穗发芽的小麦容重降低 （淀粉水解） ，面筋含量和沉降值急剧下降（蛋白质结构发生变化） ，制粉率低，面团粘度 高（蛋白质、淀粉水解） ，对面包烘焙和面条制作品质有着很大的影响，通常只能作为动物 饲料而大大降低了小麦的经济价值14,15。 1.1.2 影响小麦穗发芽的因素影响小麦穗发芽的因素 小麦穗发芽是一个由多基因控制的复杂性状，并且很大程度上受外部环境影响16。影 响小麦穗发芽的因素主要通过影响小麦籽粒对水份的吸收，籽粒的干燥程度，籽粒的休眠 第 1 章 文献综述 3 程度，以及籽粒萌发时物质的转换来实现小麦穗发芽这个特殊的生理过程。现在普遍认为 小麦成熟籽粒的休眠水平是小麦穗发芽的最大决定因素17。 1)环境 外部环境条件在小麦籽粒成熟前、后均对小麦穗发芽有影响。外部环境对穗发芽的影 响主要通过水分18和温度19,20来实现。小麦籽粒成熟前，温度对穗发芽的影响决定于小麦 品种和水分的供应。干燥条件下通常来说小麦籽粒的穗发芽机率较低。小麦籽粒成熟前， 低温可以使小麦休眠水平增加从而降低穗发芽产生的机率，而小麦籽粒成熟后，凉爽、湿 润的环境却会使小麦籽粒穗发芽的机率增加。此外，小麦籽粒经历的干湿转换越频繁，就 越有可能打破小麦籽粒的休眠，从而使其穗上发芽。其原因是水分必须通过渗透种皮，进 入种子后才能促使籽粒萌发，而干湿转换越频繁，大量的水分迅速进入种子也就越容易。 2)穗部及籽粒性状 小麦穗部及籽粒的许多形态性状，如芒长21、穗的伸展角度22、籽粒的形状23、颖壳 的类型24,25等均能通过影响小麦的穗和籽粒保持水分的能力，从而影响穗发芽的进程。麦 穗保持直立的小麦品种所保持的水分往往比麦穗弯曲的小麦品种要少，因此穗发芽率也就 更低，但这仅是影响小麦穗发芽特性的一个方面，并不一定起着决定性的作用。颖壳的紧 密程度同样可以影响小麦穗发芽，颖壳紧密性较差的品种往往会接触到更多的水分，因此 更易发生穗发芽。无芒或短芒的品种对水分的保持往往要少于长芒的品种，因此穗发芽的 机率相对长芒品种来说会低一些。以上因素相对于小麦穗发芽的遗传因素和环境因素来说， 仅为次要因素，但是在生产实践中可以通过以上性状对穗发芽不敏感的品种进行辅助选择。 3)种皮颜色 早期的研究表明，小麦穗发芽部分由遗传所控制26,27。白色种皮的品种往往比红色种 皮的品种更易穗发芽。种皮的红色和白色，由 3 个独立的基因所控制，并且控制穗发芽的 基因同控制种皮颜色的基因是相互连锁的，或者是在同一染色体的位置上十分接近。因此， 当育种家在选育白色种皮的小麦品种时，就相当于间接地选择了休眠水平较低的品种。当 所有这三个独立的种皮颜色基因纯合时种皮的颜色才会为白色。红色相对于白色是显性， 而且这种红色种皮基因是加性基因，这就意味着一个品种只具有一个红色种皮基因时，其 种皮颜色只呈现略浅的红色，若携带有三个红色种皮基因，则种皮的红颜色为最深。通常 来说，休眠水平越高的品种其所携带的红色种皮基因就越多。但有些时候，不同品系之间 即使携带有相同数目的红色种皮基因，其籽粒的休眠水平却不同，这是因为还存在着独立 吉林大学博士学位论文 4 于种皮颜色的另外一些可以控制小麦籽粒休眠水平的基因。 4)休眠 大多数小麦品种均呈现不同程度的休眠，即在小麦籽粒发育完全后，通常要经历一个 后熟阶段才能在适宜条件下正常萌发。休眠是一种经长期自然选择和人工选择的遗传性状， 其程度主要是与不同基因型种子发育过程中的生理进程和外部环境密切相关28。小麦籽粒 尤其是白皮小麦籽粒的穗发芽抗性可由籽粒休眠性所决定，籽粒体眠期长短与其穗发芽率 呈极显著负相关，即籽粒体眠期越长，越不容易发生穗发芽具有较强抗性，而体眠期短或 无体眠的品种，则比较容易发生穗发芽29。 5)激素 小麦穗发芽是一个类似小麦种子萌发的生理过程，因此在种子发育、成熟及萌发过程 中起着重要调节作用的植物激素对小麦穗发芽也具有重要作用，如 ABA（Abscisic acid， 脱落酸）和 GA（gibberellin, 赤霉素） 。其中，ABA 可以诱导种子休眠、抑制种子萌发过 程中最主要的水解酶 -淀粉酶（-amylase） ，并通过促进 淀粉酶抑制蛋白的合成来抑制 萌发30。GA 的作用同 ABA 正相反，GA 能够解除休眠，并通过诱导降解胚乳中贮藏物质 的水解酶产生来促进种子的萌发31。 6)-淀粉酶 穗发芽使小麦籽粒品质下降的主要原因就是因为以 -淀粉酶为主的水解酶活性的增强 所引起的籽粒贮藏物质的分解。虽然小麦穗发芽过程较多复杂，并受多种因素影响，但小 麦穗发芽的整个生理过程都与 -淀粉酶活性的高低密切相关，-淀粉酶活性高的品种易穗 发芽，而活性低的品种则不易穗发芽，因此 -淀粉酶的活性可以作为小麦穗发芽鉴定的重 要指标32。而抑制或降低小麦籽粒内源 -淀粉酶活性则是控制小麦穗发芽的最有效途径33。 小麦 -淀粉酶通过水解 -1,4-糖苷键来分解小麦籽粒中的直链淀粉和支链淀粉，具有多种 同功酶，目前，遗传和功能上研究的比较清楚的小麦 -淀粉酶主要有以下四种：-amy1 基 因编码合成的 -淀粉酶-1 和 -amy2 基因编码合成的 -淀粉酶-234，-amy3 基因编码合成 的 -淀粉酶-335以及 -amy1 基因编码合成的迟熟 -淀粉酶（Later mature - amylase，LM）36。和小麦穗发芽相关的淀粉酶主要为 -淀粉酶-1 和 -淀粉酶-2。-淀粉 酶-1 由位于小麦第六部分同源群的 -amy1 基因编码合成于临近成熟后期或发芽期的小麦 籽粒，主要存在于胚乳，其等电点较高，为 6.3-7.537。-淀粉酶-2 由位于小麦第七部分同 源群的 -amy2 基因编码合成于小麦籽粒形成初期或发芽期，主要存在于未成熟籽粒的外果 皮及种皮，其等电点较低，为 4.9-6.038。值得注意的是大麦的 -淀粉酶的等电点类型与小 第 1 章 文献综述 5 麦正相反，大麦 -淀粉酶-1 为低等电点，而大麦 -淀粉酶-2 为高等电点。由于位置和功能 的关系，小麦 -淀粉酶-2 水解籽粒贮藏物质的能力并不强，真正起着主要作用的是小麦 - 淀粉酶-1，-淀粉酶-1 在小麦萌发的过程中活性约占 -淀粉酶总活性的比例高达 84%。 在禾谷类作物中，普遍存在着一类可以抑制 -淀粉酶活性的蛋白，被称做 -淀粉酶抑 制蛋白。在禾谷类作物籽粒成熟的过程中，可合成一种低分子量的蛋白，在对 -淀粉酶有 抑制作用的同时，还可以使枯草杆菌蛋白酶失活，因此被称为双头的或双功能的 -淀粉酶/ 枯草杆菌蛋白酶抑制蛋白（-amylase/subtilisin inhibitor，ASI） 。迄今为此，在小麦、大麦、 黑麦、水稻中均发现报道了此种蛋白，分别简称为 WASI39、BASI40、TASI41、RASI42。 据 Mundy 等39, Henry43、Yamasaki 等44的研究表明上述 -淀粉酶抑制蛋白均可有效抑制 小麦 -淀粉酶的活性，其中 BASI 对 -淀粉酶活性的抑制作用最强（大约为 WASI 的 4 倍） ， 而 RASI 最弱（几乎无抑制作用） 。 1.2 大麦大麦 -淀粉酶抑制蛋白淀粉酶抑制蛋白 1.2.1 大麦大麦 -淀粉酶抑制蛋白结构特点和功能淀粉酶抑制蛋白结构特点和功能 大麦 -淀粉酶抑制蛋白（barley -amylase/subtilisin inhibitor，BASI） ，是一种由定位于 大麦 2H 染色体长臂的无内含子的 Isa 基因（EMBL 登录号：Z12961）所编码的由 181 个 氨基酸组成并含有 2 个二硫键（Cys44Cys90 和 Cys144Cys148）的单链蛋白。大麦 -淀 粉酶抑制蛋白分子量约为 20000Da，等电点为 7.3，属于具有 -trefoil（三叶草）拓扑结构 的 Kunitz 型胰蛋白酶家族45,46，它与同属该家族的小麦 -淀粉酶抑制蛋白和水稻 -淀粉酶 抑制蛋白的同源性分别达到 92%40和 58%47。大麦 -淀粉酶抑制蛋白是一种双功能蛋白， 即可以选择性地抑制高等电点的大麦 -淀粉酶-2 和小麦 -淀粉酶-1 活性，同时也可以抑制 枯草杆菌蛋白酶活性，最近有研究表明大麦 -淀粉酶抑制蛋白还可抑制真菌木聚糖酶活性48。 大麦 -淀粉酶抑制蛋白除了通过结合 -淀粉酶降低其活性而抑制穗发芽49，还可以通过抑 制细菌蛋白酶和真菌蛋白酶的活性而起到植物保护的作用。 1.2.2 大麦大麦 -淀粉酶抑制蛋白的时空表达及影响因素淀粉酶抑制蛋白的时空表达及影响因素 大麦 -淀粉酶抑制蛋白是在大麦籽粒的发育过程中由胚乳合成的一种贮藏蛋白，可占 成熟种子总蛋白的 0.5%50。大麦 -淀粉酶抑制蛋白的 mRNA 于大麦开花后 14 天出现在发 育种子的胚乳中，开花后 20 天其 mRNA 转录水平达到稳态51。当种子发芽时，位于糊粉 层的大麦 -淀粉酶抑制蛋白的 mRNA 转录水平受 ABA 和 GA 调控，ABA 处理可以提高其 吉林大学博士学位论文 6 转录水平，而 GA 处理则会降低其转录水平。ABA 和 GA 这两种激素对大麦 -淀粉酶抑制 蛋白的调控作用同前文所述的对 -淀粉酶的调控作用正相反。大麦成熟籽粒的糊粉层经离 体培养发现大麦 -淀粉酶抑制蛋白 mRNA 增加，但大麦 -淀粉酶抑制蛋白量并没有发生 变化，而经 ABA 处理后，mRNA 和蛋白量均有所增加，由此说明 ABA 主要是通过转录后 水平来调控大麦 -淀粉酶抑制蛋白的表达52。Liu 等通过大麦离体胚培养也证明了以上观 点，即 ABA 的主要作用是维持大麦 -淀粉酶抑制蛋白 mRNA 的稳定，而并不影响大麦 - 淀粉酶抑制蛋白的翻译水平53。由于以上实验均为体外（in vitro）进行，因此大麦 -淀粉 酶抑制蛋白的表达模式及部位并不十分确定，Furtado 等54通过对转入了 Isa 启动子连接 GFP 的转基因大麦进行检测，认为大麦 -淀粉酶抑制蛋白主要在大麦籽粒的果皮表达。 1.2.3 大麦大麦 -淀粉酶抑制蛋白的作用机制淀粉酶抑制蛋白的作用机制 小麦穗发芽严重发生时会使面粉的品质降低，甚至失去了食用价值，即使穗发芽程度 轻或不明显，但小麦籽粒内 -淀粉酶活性已经升高，也会给品质带来不利的影响。肖世和 等55和原亚萍等56以附加有大麦 2H 染色体的小-大麦 2H 异附加系为材料，发现大麦 -淀 粉酶抑制蛋白可在小麦基因背景中通过与小麦 -淀粉酶结合而降低小麦 -淀粉酶活性，从 而达到改善小麦淀粉品质的目的，同时原亚萍等通过对大麦 -淀粉酶抑制蛋白和小麦 -淀 粉酶共培养物的等电聚焦电泳图谱扫描表明，大麦 -淀粉酶抑制蛋白除了通过结合小麦 - 淀粉酶-1 而降低其活性的同时，也降低了小麦 -淀粉酶-2 的活性，但大麦 -淀粉酶抑制蛋 白抑制小麦 -淀粉酶-2 的机制并不清楚。Zawistowka 等发现向已发芽或 -淀粉酶性高的小 麦籽粒所磨制的面粉添加大麦 -淀粉酶抑制蛋白，可以大大改善面粉的加工品质57。 Masojc 等58和 Jarrett 等59利用 Zawistowdki 等60报道的大麦 -淀粉酶抑制蛋白单克隆抗体 对多个不同的大麦栽培种进行 ELISA（Enzyme linked immunoserbent assy, 酶联免疫吸附） 检测，结果表明大麦 -淀粉酶抑制蛋白的含量存在着基因型差异，但并不存在环境效应。 Bundock 等61对 16 个大麦品种 Isa 基因的启动子、转录本、和 3-UTR 区进行检测，发现 多个 SNPs 和 Indel（缺失） ，而且大麦野生种的重组率远高于大麦栽培种。Cronin 等62通 过对以色列不同环境收集而来的 178 个野生野大麦品种的 Isa 基因进行检测，共鉴别出 16 个 SNPs（Single nucleotide polymorphisms，单核苷酸多态性） ，说明 Isa 基因的位点发生了 大量的重组，且和降雨量、湿度、纬度等和水分相关的环境因素高度相关。为了进一步明 析大麦 -淀粉酶抑制蛋白的功能并验证大麦 -淀粉酶抑制蛋白同 -淀粉酶、枯草杆菌蛋白 酶的相互作用及其功能位点，分别通过原核表达63和真核表达64获得了重组蛋白。并最终 第 1