课件：第章蛋白质的通性纯化和表征.ppt

第三章,蛋白质的通性、纯化和表征,一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 三、蛋白质分离纯化的一般原则 四、蛋白质的分离纯化方法 五、蛋白质相对分子量的测定 六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定,本 章 重 点,蛋白质分离基于蛋白质的哪些性质？ 主要纯化方法的原理？ 大概能够针对蛋白质的性质的差异设计相应的实验方案对蛋白质进行分离,一 蛋白质的酸碱性质,1. 蛋白质分子的可解离基团,2. 等电点：在某一pH,蛋白质所带的正电荷 与负电荷恰好相等，静电荷为零，这一pH称谓 蛋白质的等电点,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 蛋白质所带电荷性质取决于可解离基团的种类和数目以及溶液的pH。,每种蛋白质都有它特有的等电点，这也是鉴别蛋白质的指标之一。,蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量与等电点的关系:,等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类和数目有关。,3. 等离子点,蛋白质的等电点在有中性盐存在下可以发生明显的变化。 Ca2+，Mg2+，Cl-，SO42- 等离子点是蛋白质在没有其它盐类干扰的纯水中，蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的溶液的pH值。等离子点是一个特征常数。,二 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀,蛋白质溶液中，蛋白质分子的直径介于1100nm，该分散系统为胶体溶液系统。布郎运动、丁道尔现象、不能透过半透膜）。,胶体系统保持稳定的三个因素 颗粒大小在1100nm范围内 颗粒表面带有同种净电荷 与水形成水化层,（一）胶体性质,由于蛋白质分子很大，在水中形成胶体溶液。蛋白质主要是指球状蛋白质，它的亲水基团都在表面，因此与水有很大的亲和力，成为亲水胶体。,蛋白质的亲水胶体溶液是相当稳定的，一方面由于蛋白质表面的亲水基团会吸引它周围的水分子，使水分子定向排列在它的周围，形成“水化层”。另一方面由于蛋白质在非等电点时带有同种电荷，与周围的反离子构成稳定的“双电层”，同种电荷相斥，也使蛋白质分子保持一定的距离而不会聚合。,稳定亲水胶体的因素： 水化膜 表面电荷,当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析出，这种现象称为蛋白质的沉淀。,应用:,(1)蛋白质分离纯化,(2)解毒,(3)临床检验,（二）蛋白质的沉淀,水化层,蛋白质胶体溶液沉淀作用示意图,(1) 盐析法( salting out),向蛋白质溶液中加入大量中性盐使蛋白质沉淀称为盐析。,常用的中性盐：,不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性。,硫酸铵、,硫酸钠、,氯化钠等,使蛋白质沉淀的方法,概念：,特点：,作用原理:,盐离子与水亲和力极强，脱去蛋白 水化层而聚集沉淀,(2) 有机溶剂沉淀法,使蛋白质脱去水化层,又能降低溶液的介电常数，使蛋白质表面电荷减少，导致蛋白质分子聚集而沉淀。,必须在低温下操作,注意事项:,尽量缩短处理的时间,及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去,甲醇、乙醇、丙酮,缺点：,原理:,常用有机溶剂:,常会使蛋白质变性,重金属离子如Cu2+、Hg2+、Ag2+、Pb2+等带有正电荷，能与蛋白质分子中带负电的基团结合，生成不溶性的重金属蛋白盐而沉淀。,(3) 重金属盐沉淀法,此法常使蛋白质变性失活。,若溶液pH大于蛋白质的pI，沉淀更易发生,缺点：,原理:,生物碱试剂(如鞣酸、苦味酸、钨酸等)，某些酸类(主要是指三氯醋酸、磺酰水杨酸和硝酸等)，与带正电的蛋白质 结合生成不溶性的盐而沉淀。,(4) 生物碱试剂和某些酸类沉淀法,反应溶液的pHpI，确保蛋白质以阳离子形式存在,缺点：,原理:,常引起蛋白质变性,注意事项:,（5）加热变性,几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固 当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全，最迅速？ 蛋白质天然结构解体，疏水基外露，破坏了蛋白质的水化层 破坏电荷情况,（一） 纯化的总目标 （二） 蛋白质分离纯化的一般原则,三 蛋白质分离纯化的一般原则,（一）目的,蛋白质在生物体中一般都是以复杂的混合物形式存在，在实际工作中，要研究或应用某种蛋白质，必须将其分离提纯到一定的水平。, 研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理化学性质，需要纯的均一的甚至是晶体的蛋白质样品； 研究活性蛋白质的生物功能，不但需要把样品提纯到一定的水平，而且样品还要保持它的天然构象，要尽量避免因变性而失活； 在制药工业中，需要把某些具有特殊功能的蛋白质提纯到规定的标准，特别是要把一些具有干扰或拮抗性质的成分除去。,1、总目标,（1）增加制品的纯度（purity）或比活性（specific activity）即增加单位蛋白质重量中目标蛋白质的含量或生物活性； （2）并且使目标蛋白质的产量达到最高值。,（二）一般原则,2、分离提纯的一般程序,含有目标蛋白质的动植物组织、细胞或微生物体 前处理 可溶性蛋白质混合物抽提液 粗分级分离 已除去大量杂质的蛋白质浓缩液 细分级分离 高纯度的蛋白质制品,第一步：前处理,破碎含有目标蛋白质的动植物组织、细胞培养液或微生物体，加入适当的缓冲液使目标蛋白质以溶解的方式释放出来并保持其天然活性，然后采用离心或过滤的方式弃去固体杂质，得到蛋白质混合物抽提液。 原材料选择 组织和细胞破碎(匀浆器，组织捣碎机 超声破碎，酶处理） 抽提 离心,将组织和细胞破碎 动物组织和细胞：电动捣碎机 匀浆器 超声波处理 植物组织和细胞：石英砂+提取液，研磨 纤维素酶处理 细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理 （分解肽聚糖） 差速离心法收集细胞的某一组分 （differential centrifugation),第二步：粗分级,经前处理以后获得的蛋白质混合物提取液一般成分复杂、目标蛋白质浓度较低， 因而首先采用一些简便、处理量大的作用方式，以除去其中的大量杂质，同时使蛋白质得到浓缩。 该步操作一般包括盐析、等电点沉淀及有机溶剂分级分离等。,第三步：细分级,对经粗分级分离后，体积已经较小，且已除去了大量杂蛋白的蛋白质样品进行进一步的处理，以使样品得到更进一步的纯化。 包括层析（GF，IEC，AC）、电泳、结晶等技术。,四 蛋白质的分离纯化方法,分离提纯蛋白质的各种方法主要是利用蛋白质之间的各种特异性的差异，包括： （1）分子大小； （2）溶解度； （3）电荷不同； （4）选择性吸附； （5）对配体分子的生物学亲和力等。,（一）根据分子大小不同的纯化方法,1 透析(dialysis)和超滤(ultrafiltration) 2 凝胶过滤(gel filtration),不同分子量的蛋白质分子,1 透析和超滤,* 透析(dialysis) 利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质大分子与其他小分子物质分开的方法。,* 超滤法 应用正压或离心力，使水和其他小分子通过半透膜而蛋白质被截留在膜上，达到浓缩或脱盐粗分级的目的。,透析与超过滤简易装置,超滤装置,（1）凝胶过滤的介质,2 凝胶过滤,凝胶的网孔大小决定分离范围,能被该凝胶分离开来的蛋白质混合物的相对分子质量范围 Sephadex G-50 1 50030 000 有时用排阻极限来表示分离范围的上限,排阻极限指不能扩散进入凝胶网孔的最小相对分子量,如Sephadex G-50的极限为30 000,常用的凝胶 : 葡聚糖凝胶（商品名Sephadex） 是由线型的-1,6-葡萄糖与1-氯-2,3-环氧丙烷反应而成,商品名为Sephadex 。 聚丙烯酰胺凝胶(商品名Bio-GelP) 是由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺共聚而成，商品名为Bio-Gel P。 琼脂糖凝胶(Sepharose，Bio-gel A) 是从琼脂中分离制得的，商品名为Sepharose或Bio-Gel A,交联葡聚糖凝胶 Sephadex,琼脂糖凝胶 Sepharose,以甲叉双丙烯酰胺为交联剂，将丙烯酰胺（单体）聚合而成,聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-gel P）,(2)凝胶过滤的原理,床体积（Vt）膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积（Vt） 外水体积（Vo）：凝胶珠孔隙的水相体积 内水体积（Vi）:凝胶珠内部的水相体积 基质体积（Vm）：基质自身具有的体积 洗脱体积（Ve）：自加样开始到该组分的洗脱峰出现时所流出的体积。,关系： VtVoViVg 由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有： VtVoVi,物质在凝胶层析柱被排阻的范围均在均在0100之间，被排阻的程度由可用分配系数Kav表示 Kav:分离化合物在内水和外水体积中的比例关系 KavVeV0VtV0 分离物分子质量大，Kav值小，反之，则增大,Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。 对于完全排阻的大分子，洗脱体积VeVo，Kav=0； 对于完全渗透的小分子，洗脱体积VeVt，Kav=1； 分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间，0Kav1。,Kav既是判断分离效果的参数，又是测定蛋白质分子量的重要依据。,应用,凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。 利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、去热源和脱色。,（二）根据溶解度差别纯化的方法,影响蛋白质溶解度的外界因素主要有： （1）溶液的pH， （2）离子强度I， （3）介电常数， （4）温度T。 根据蛋白质分子结构的特点，适当改变上述外界因素，就可以选择性的控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度，作为分离纯化蛋白质的一种手段。,1. 等电点沉淀和pH控制,2. 盐溶和盐析,盐溶(salting in)指的是低浓度的中性盐可以增加蛋白质溶解度的现象。 盐析(salting out)指的是当中性盐的离子强度增加到足够高时，（如饱和或半饱和的程度），很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来的现象。 常用盐析盐类： (NH4)2SO4 ，NaCl等,盐溶原理示意图,盐溶主要由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电表层使蛋白质彼此排斥，而蛋白质分子与水分子之间的相互作用却加强。 盐析原因：在蛋白质溶液中大量加入中性盐使水的活度降低，原来溶液中大部分自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子之间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层,盐析原理示意图,应用,盐析是一种最常用的分级分离的方法之一,利用好了一步即能 除去大量的杂蛋白.现在已有的很多蛋白水解酶或其酶原都 已经利用盐析进行了沉淀并结晶,如:胰凝乳蛋白酶原,胰蛋白 酶等 优点:保持蛋白质的天然构象,能再溶解 下面以卵清蛋白的分离为例看:,鸡蛋清,球蛋白沉淀,滤液,卵清蛋白晶体,半饱和(NH4)2SO4,3. 有机溶剂分级法,与水互溶的有机溶剂（如乙醇和丙酮）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低， 原因之一是降低了介质的介电常数，蛋白质表面的离子化程度减弱，水化程度降低，因此促进了蛋白质分子的聚集沉淀； 原因之二与盐析相似，有机溶剂与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质聚集沉淀。,2019/8/23,53,可编辑,有机溶剂分级分离原理示意图,4 温度对溶解度的影响,在低离子强度时，蛋白质的溶解度大多数在一定范围（约0-40）内是随着温度增加而增加的。 但在40-50以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，一般在中性介质中就会失去溶解力。 大多数蛋白质在低温下比较稳定。因此，蛋白质的分级分离操作一般都要求在低温下进行。,（三）根据电荷不同的分离方法 1 . 电泳 电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率不同，在电泳时可以分开。,F=Ff,qE=fV,=v/E,泳动度,电泳的发展,a. 自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。 b. 区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。 1）纸电泳：用滤纸作支持物。 2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。,Protein Denatured,Partial Denatured,滤纸电泳 Cellulose,薄层电泳 (TLE) Cellulose acetate,胶体 Starch Gel, 电泳形式的演进,圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。 平板电泳：铺有凝胶的平板上进行的电泳。,纯化中应用最多的是聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳，它们既可以作为蛋白质纯度检验方法，也可以纯化、制备蛋白质。,（1） PAGE： PAGE电泳：以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的电泳 凝胶板分为两部分：,浓缩胶,分离胶,PAGE垂直平板电泳示意图,高效的分辨率,浓缩效应,电荷效应,分子筛效应,PAGE的三种分离效应,1. 加入 Seperating gel约23,2. 立即加入蒸餾水2 ml以壓平膠體,蒸餾水,Separating gel,分离胶的制备,Separating gel,Stacking gel,comb,1.加入 stacking gel,2. 插入comb,注意： 浓缩胶要加满 插入comb 時要注意避免有气泡,浓缩胶的制备,Separating gel,Stacking gel,垂直電泳,Buffer,dye,加样,（2）等电点聚焦,蛋白质是两性电解质 当pH=pI时净电荷为零，在电场中既不向正极也不向负极移动，此时的pH就是该蛋白质的等电点(pI),以PAG为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体，在电场作用下，两性电解质载体在凝胶中移动，形成pH梯度，蛋白质在凝胶中迁移至其pI的pH处，即不再泳动而聚焦成带，这种方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(isoelectric focusing-PAGE，IEF-PAGE),原理:, 等电聚焦的运作机制：,-,pH 3 5 7 9 11,-,-,-,-,-,-,Adapted from Alberts et al (2002) Molecular Biology of the Cell (4e) p.487,-,-,（3）双向凝胶电泳,2.离子交换层析法 不同载体： 离子交换纤维素 离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应 离子交换交联琼脂糖,Equilibration,离子交换剂的构成 纤维素O-CH2COO-Na+,基质,功能基团,反离子,羧甲基离子交换剂组成,DEAE anion exchanger,阴离子交换基,强碱性，聚苯乙烯树脂,弱碱性，二乙氨乙基纤维素,CMC Cation Exchanger,阳离子交换基,强酸性，聚苯乙烯树脂,弱酸性，羧甲基纤维素,弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂,离子交换剂,亲和层析法(AC),（七）利用对配体的特异生物学亲和力 的纯化方法,Pr,琼脂糖小珠,配体： 凝集素， 抗原，抗体 金属螯合剂,杂质,杂质,配体的选择,可选择配体的种类： 抑制剂 效应物 酶的辅助因子 类似底物 抗体 其它（外源凝集素，PolyA， PolyU 金属离子）,（六） HPLC,原理：，GF，吸附层析 技术上的改进 颗粒力度小而均匀，机械性能强化学性能稳定 高压柱，计算机辅助设备,分辨率提高，效率提高,五蛋白质相对分子量的测定 1.凝胶过滤法测定相对分子质量,Note：,蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不直接取决于分子质量，而是分子的半径。 因此用凝胶过滤法测定分子质量，标准蛋白质（已知Mr）与待测蛋白质必须具有相同的分子形状（球形） 分子形状为线形或能与凝胶发生吸附作用的蛋白质，不能用此法测定。,将已知分子质量的标准物质，在同一凝胶柱上以相同条件进行过滤层析，在一定的范围内，各个组分的Ve与其分子量的对数成线性关系。 Veb lg MWc,优点：,设备简单，不要求复杂的仪器 对待测样品的纯度要求不高。待测样品可以是不纯的，只要他具有专一的生物活