课件：气相色谱法测定中药中农药残留量的研究与应用.ppt

气相色谱法测定中药中农药残留量的研究与应用,-特点及分析原理,农药残留量系指施用的农药残存在生物体和环境中的农药原体、有毒代谢物，降解物和杂质的总称。 农药残留量过高，已经严重影响到人民用药健康，制约了我国中药出口贸易的发展。,中药中农药残留分析是一门综合性很强,涉及面很广的分析学科。进行农残检测是对样品中的农药成分进行定量和定性工作，由于中药材成分本身复杂，农药品种也复杂，农药残留量极低，加之药材种类繁多,收获后须经加工才能使用，其中也可能受到其它化学物污染，药材中痕量农药的分离和检测有一定难度。,1中药的农药残留问题 2主要分析方法 3气相色谱法在农药残留量分析中的特点及优势,1中药的农药残留问题,中药产业的发展与现代化对中药材的要求越来越高，降低农药残毒和重金属对环境和药材的污染是保证中药安全性的重要条件。 中药现代化发展纲要：加强中药材规范化种植和中药饮片炮制规范研究，建立中药材和中药饮片的质量标准及有害物质限量标准，全面提高中药材和中药饮片的质量。 中国药典2000版首次收载了有机氯类农药残留量的测定法，2005版则增加了拟除虫菊酯类、有机磷类农药残留量的测定法。标志着我国对于药材农药残留的研究愈加重视，并开始规范化、标准化、法制化。,中药中农药残留量测定研究目前的发展概况 中药材、中药制剂成分复杂，而农药在中药中的残留量一般很低，使得农药的提取、分离、净化与富集难度增大，严重干扰农药残留量的测定。 从事中药中农药残留测定研究的单位较少，大部分研究及开展单位只停留于传统的提取、分离手段及落后的填充柱气相色谱测定技术 。,被测农药主要集中于有机氯类农药，其中以六六六、滴滴涕为主。 有机磷、有机氮和拟除虫菊酯类农药的检测近些年有了发展，使中药中农药残留量测定全面展开。 近几年，先进的提取、净化手段和检测技术逐步得到应用和推广 。,农药的种类 按防治对象，农药可分成杀虫剂、杀菌剂、除草剂、杀鼠剂、杀线虫剂、杀螨剂等。 按作用或效用，杀虫剂又可分成胃毒剂、触杀剂、熏蒸剂、驱避剂、拒食剂、昆虫生长调节剂、不育剂等；杀菌剂又可分成保护剂和治疗剂等。 按化学成分人工合成杀虫剂又可分成有机氯化合物、有机磷化合物、氨基甲酸酯、有机氮化合物、拟除虫菊酯、有机氟化合物、有机锡化合物、特异性杀虫剂等；杀菌剂又可分成有机氯杀菌剂、有机磷杀菌剂、有机硫杀菌剂、有机汞杀菌剂、无机杀菌剂、抗菌素等。,有机氯类农药 有机氯农药化学性质稳定，半衰期特别长，降解速度很慢，长期在水域、土壤和生物体内贮存，并在生物链中蓄积导致严重的全球性环境污染。 1、世界各国已在70年代末80年代初禁止使用有机氯农药，虽已经二十余年，但目前仍在土壤、农产品、中药材中检出有机氯农药。 2、药材中有机氯农药检出率相当高，特别是栽培药材中药用部位为地下部分受污染机会最大,拟除虫菊酯类农药 拟除虫菊酯类农药是二十世纪七十年代工合成的一类仿生杀虫剂，其杀虫活性高，毒性相对较低，有良好的防治害虫效果。 1、生产和使用逐年增长，应用也较为普遍，已成为主要的农用、卫生杀虫剂之一。 2、该类农药系神经性毒物，对中枢神经系统有麻醉作用。,有机磷农药 有机磷农药属有机磷酸酯化合物，是应用较早且广泛使用的一大类农药，品种繁多，作用广泛，毒性可分为高、中、低。 1、有机磷农药也是一种神经性毒物，其主要毒理是与体内的乙酰胆碱酯酶结合后，生成较稳定的磷酰化胆碱酯酶，引起中枢神经系统的紊乱。 2、有机磷农药对人、畜的毒性较大，不少品种还属于剧毒，由于长期大量使用，有机磷农药残留污染环境的问题已相当严重。 3、有机磷农药化学性质不稳定，易受热、酸碱而降解，不易长期残留，经过各种条件进入生物体内的量远小于有机氯农药，因此已取代有机氯农药。但对于一些高毒类品种残留问题仍要引起重视。,其它农药 氨基甲酸农药 是继有机磷农药后一种新型有机杀虫剂，是有机氮的一种，目前使用量较大。 1、主要中毒机理是抑制胆碱酯酶活性，类似有机磷作用，但比有机磷毒性低，具有选择性强，杀虫效力高，作用迅速，对人畜毒性低，多属种、低等毒类。 2、氨基甲酸酯农药在碱笥和高温条件下很容易水解，因此施用后很短时间内可降解为代谢物，这些代谢物通常有相同或更强的活性，因此在农残监测时应将代谢物考虑其中。,百菌清 是一种广谱杀菌剂，已广泛用于中药材的病害的防治，其急性毒性较低，是低毒农药。 其主要代谢物之一4-羟基-2,5,6-三氯间苯二甲腈毒性较母体大，其慢性毒性正引起人们的重视。 有文献采用GC-ECD方法分析中药材上百菌清及其代谢物残留，并测定部分中药材栽培期间喷施百菌清后植株上消解动脉及收获时药用部位的残留水平，实验结果表明百菌清消解速度较快，植物各部位受污染程度大致为叶花，果根和根茎。,多菌灵 是一种高效低毒杀菌农药，可防治多种植物病害。 薛健等人采用HPLC法测定采收期收获的大青叶，未检出多菌灵。同时他们还测定金银花中多菌灵残留，结果也未检出。,甲基异柳磷、克线磷 甲基异柳磷是近年来研制的一种新型土壤杀虫剂，是取代六六六农药的理想药剂，克线磷是防治作物要结、孢囊与自由线早的杀线剂。 这两种农药均为高效、低毒、药效长的农药。 杨昌金等测定了当归中甲基异柳磷、克线磷残留量。,2主要分析方法,农药品种繁多，中药成分复杂，中药中残留农药量均为痕量级，应采用高灵敏、高选择性、具有分离分析双重功能的分析方法，才能准确测定。气相色谱法简单灵敏，选择性高，它的出现大大提高了农药残留量的检测水平，它在农残监测上的应用使得农残分析进入了多种农药的多残留分析阶段。,.气相色谱法,气相色谱法是农药残留测定主要的分析手段，对绝大部分农药均能检测出，过去以填充柱为主，近年来随着毛细管柱和新型检测器的农残分析的普及应用，大大提高了检测灵敏度，缩短了分析时间 特点 :（1）分离效能高（2）检测灵敏度高（3）分析速度快（4）应用范围广（5）样品用量少,基本原理 混合样品的气流通过固定相时，根据各组分对固定相的吸附强弱不同使不同成分得到分离。,气相色谱仪的基本部件 1 载气 常用的载气主要有氮、氩、氢和二氧化碳等。这些气体一般都由高压气瓶供给。 2 进样器 气相色谱仪可以用于分离固相、气相和液相标本。液相标本采用微升注射器穿过橡皮隔片注入，气相标本采用特种气相注射器注入。 3 柱及加热炉 色谱柱一般由金属或玻璃制成，通常采用的柱长2m-4m，内径2mm, 毛细管柱长度可达20m150m，内径为0.2mm。 载体一般采用惰性、多孔的固体颗粒。多由硅藻土或玻璃珠制成，分析不同极性的微生物化合物，为了获得最适的分离条件，要求有不同固定相的载体。目前比较常用的有：聚乙二醇（CarbOwax 20M）、F F A P（聚乙二醇20M和2-硝基对苯二甲酸的反应产物），OV17（苯基甲基硅酮）。OV-210、SE-30（甲基硅酮）、Chromosorb G（白色硅藻土载体）等。柱加热炉在温度控制上是非常重要的。 4 纪录仪 5 数据处理装置 一般均附有数据处理计算机。,1、该法最小检出量可达pg至fg级，毛细管气相色谱法己成为农残检测工作中应用最广泛，技术最成熟的技术。 2、凡沸点在500以下，分子量在400以下的化合物，原则上均可采用气相色谱法分析，目前80以上的农药都可采用该法。 3、气相色谱法可使用多种高录敏率、高选择性的检测器，达到准确的定性和定量测定。如电子捕获检测器(ECD)对含强电负性元素如卤素的物质敏感，氮一磷检测器(NPD)对含氮和磷的有机物敏感，火焰光度检测器(FPD)对含硫和磷的有机物敏感。这些高灵敏的检测器最低检测量可达到10-1210-14g级。,.气相色谱质谱法,GCMS联用是目前相当成熟的技术，可大大提高分析灵敏度，对多种农药进行确认和结构鉴定。 农药残留在环境中的量很低，因此目前GCMS和GCMSMS联用技术在农残分析中应用越来越广泛。它们采用色谱保留时间和质谱数据对化合物进行分析，提高了仪器灵敏度提高对农药的检出能力，有利于未知物的定性，保证分析结果的可靠性。 赵云峰等报道了人参中有机氯农药残留检测的GCMS法，孙秀燕等建立了人参和金银花中有机磷农药残留量的GCPCIMS法，PCI为正化学电离模式。,一般样品背景干扰大，使得处理过程繁琐，且降低回收率，多级质谱GCMSn技术的发展为复杂样品微量农药定性定量分析开辟了新途径，它选择目标化合物的特征离子为母离子，对其进行诱导碰撞，用其子离子图谱进一步确证分析对象的结构。 提高分析能力的基础上提供足够的结构信息，用于结构定性。它还可以将在色谱上不能完全分离的共流出物利用时间编程和多通道检测将其完全分开，因此特别适用于分析背景干扰严重、定性困难、样品组分含量低的情况，近年来逐渐被世界各国权威检测机构用于仲裁分析。,3 气相色谱法在农药残留量分析中的特点及优势,由于气相色谱法具有高选择性、高分离效能、高灵敏度、快速等优点,因而是农药残留量检测最常用的方法之一,易气化、气化后又不发生分解等现象的农药均可采用气相色谱法检测。 .色谱柱 .检测器 .中药农药残留量分析的前处理方法,.色谱柱,色谱柱是气相色谱分离的核心，固定液选择合适与否，决定农药组分分离程度的好坏。 常用固定液包括（按极性大小）：OV-101、V-1、SE-30、DC-200、SP-2100、OV-17、OV-210F-1、OV-225、PEG-20M、DEGS 等，混合固定液包括 10DC-20015QF-1、1.5OV-171.95QF-1、3OV-2255OV-101 等。,有机氯农药分析时，毛细管色谱柱可选用弱极性或中等极性的SE-54，HP-608，DB-1等，药典和多数文献均采用不同规格的SE-54毛细管柱，采用程序升温方式，使得待测农药完全分离。有文献比较SE-54、OV-1701两种柱子后认为0V-170l柱的分离效果好些。 分离拟除虫菊酯类农药可选用弱极性的SE-54毛细管柱。 分离有机磷农药采用的毛细管柱有SE-54、0V-1701、HP-1。氨基甲酸酯农药采用SE-30固定液合适。,多采用毛细管柱来分析农药残留量，尤其在 GC-MS中，毛细管柱占绝对优势。 毛细管气相色谱法在农残分析中占绝对优势，填充柱有较大的柱容量、但分辨率不高，柱效低，一些组分不能完全分离。 毛细管柱柱效高而柱容积小，进样量受到限制，大口径毛细管柱兼有填充柱、毛细管柱的优点，可大剂量进样，无需分流，分析速度快，分离效果好，适合多残留农药的分析。,填充柱,填充柱 填充柱的柱管通常为长1-3m，内径2-3mm的不锈钢管，为节省柱温箱空间而将柱管弯成环状。 在管内壁涂渍液体物质（气-液色谱） 在管内填充固体吸附剂（气-固色谱）。,气-液色谱 原理： 各溶质在气相（流动相）和液相（固定相）间分配系数不同达到分离。 固定相： 涂渍在惰性多孔固体基质（载体或担体）上的液体物质，常称固定液。使用过的气-液色谱固定液上千种，常用的固定液有聚二甲基硅氧烷、聚乙二醇、含5或20苯基的聚甲基硅氧烷、含氰基和苯基的聚甲基硅氧烷、50三氟丙基聚硅氧烷。 常用的基质： 无机载体（如硅藻土、玻璃粉末或微球、金属粉末或微球、金属化合物）和有机载体（如聚四氟乙烯、聚乙烯、聚乙烯丙烯酸酯）。,气-固色谱 气-固色谱的固定相是固体吸附剂，分离是基于样品分子在固定相表面的吸附能力的差异而实现的。常用的固体吸附剂有碳质吸附剂（活性炭、石墨化碳黑、碳分子筛）、氧化铝、硅胶、无机分子筛和高分子小球。 气-固色谱不如气-液色谱应用广泛，主要用于永久气体和低沸点烃类的分析，在石油化工领域应用很普遍。,毛细管柱,毛细管气相色谱法是采用高分离效能的毛细管柱分离复杂组分的一种气相色谱法。毛细管柱与填充柱相比在柱长、柱径、固定液液膜厚度、容量以及分离能力上都有较大的差别.,毛细管柱的内径一般小于1mm，它可分为填充型和开管型两大类。 1. 填充型 分为填充毛细管柱（先在玻璃管内松散地装入载体拉成毛细管后再涂固定液）和微型填充柱（与一般填充柱相同，只是径细，载体颗粒在几十到几百微米）。目前填充柱毛细管已使用不多。 2.开管型 其固定液的涂渍方法不同，可分为： （1）涂壁开管柱：将内壁经预处理再把固定液涂在毛细管内壁上。 （2）多孔层开管柱：在管壁上涂一层多孔性吸附剂固体微粒，不再涂固定液。 （3）载体涂渍开柱管：为了增大开柱管内固定液的涂渍量，先在毛细管内壁涂一层载体，如硅藻土载体，在此载体上再涂固定液。 （4）交联型开柱管：采用交联引发剂，在高温处理下，把固定液交联到毛细管内壁上。目前大部分的毛细管属于此类型。 （5）键合型开柱管： 将固定液用化学键合的方法键合到涂敷硅胶的柱表面或经表面处理的毛细管内壁上，由于固定液是化合键合的，大大提高了热稳定性。,2019/8/24,33,可编辑,毛细管柱的特点 （1）渗透性好（载气流动阻力小），可使用长的色谱柱。 （2）相比率大，有利于提高柱效并实现快速分析。 （3）柱容量小，允许进样量小。由于毛细管柱涂渍的固 定液仅几十毫克，液膜厚度为0.351.5m，柱容量小。对液体样品，一般采用分流进样技术。 （4）总柱效高。 （5）毛细管柱（开口柱）的涡流扩散项为零。毛细管的气相、液相传质阻力项的影响因素复杂。,.检测器,检测器是测量载气流中不同组分及其含量的敏感器, 也可以说是色谱仪的感觉器官, 应依据待测组分的性质选择合适的检测器。 随着毛细管柱和进样系统的不断完善,毛细管气相色谱的应用更加广泛。尽管样品前处理的净化效果越来越好, 但样品中的干扰物是不可避免的, 所以现代气相色谱一般采用选择性检测器, 理想的检测器当然只对“目标”农药响应, 而对其它物质无响应。但农药几乎都含有杂原子O、P、S、N、Cl、Br 和 F, 因此不同类型的农药应该使用不同类型的检测器。,3.2.1电子捕获检测器( ECD),电子捕获检测器(electron capture detector, ECD)是农药残留物分析中对有机氯的测定最常用的检测器。 特点：具有高选择性和高灵敏度的离子化检测器, 其选择性只对具有电负性的物质有响应, 如对含卤素、硝基、氰基、氧原子等化合物有很强的响应, 且电负性越强,其检测器灵敏度越高(可高达110-14g/ mL), 线性范围一般为103,最高可达 104105, 被广泛应用于有机氯农药和其它含电负性原子的农药残留量检测。,工作原理：检测室内的放射源放出-射线粒子（初级电子），与通过检测室的载气碰撞产生次级电子和正离子，在电场作用下，分别向与自己极性相反的电极运动，形成检测室本底电流，当具有负电性的组分（即能捕获电子的组分）进入检测室后，捕获了检测室内的电子，变成带负电荷的离子，由于电子被组分捕获，使得检测室本底电流减少，产生倒的色谱峰信号。载气一般选用高纯氮气，气体中微量氧和微量水会污染检测室，必须用净化管除去。ECD是浓度型选择性检测器，对负电性的组分能给出极显著的响应信号。用于分析卤素化合物、多核芳烃、一些金属螯合物和甾族化合物。,3.2.2 氮磷检测器( NPD),氮磷检测器(nitrogen - phosphorus detector, NPD)亦称碱火焰离子化检测器(AFID)，它只对含氮、磷化合物有很高的灵敏度和选择性 ,专用于痕量氮、磷化合物的检测。 工作原理：它是在FID的喷嘴和收集极之间放置一个含有硅酸铷的玻璃珠。这样含氮磷化合物受热分解在铷珠的作用下会产生多量电子，使信号值比没有铷珠时大大增加，因而提高了检测器的灵敏度。因此这种检测器多用于微量氮磷化合物的分析中。,张莹等利用 NPD 测定了茶叶、麦子、蜂蜜、葡萄汁、葡萄酒、卷心菜、苹果、人体体液中的有机磷、甲基对硫磷、抑菌灵、毒死蜱、杀螟松、希酮菌、乙菌利、杀菌利、异丙定、三嗪除草剂等。,3.2.3 火焰光度检测器( FPD),火焰光度检测器(flame photometric detector,FPD)是利用火焰中化学发光作用发展起来的一种高灵敏度、高选择性检测器, 它只对硫、磷化合物有讯号, 因此也叫硫磷检测器。 特点：主要用于含硫、磷化合物, 特别是硫化合物的痕量检测。通常也用于其它杂原子化合物的痕量检测，FPD为质量型选择性检测器，主要用于测定含硫、含磷化合物，其信号比碳氢化合物几乎高一万倍 。,工作原理：组分在富氢（H2O23）的火焰中燃烧时组分不同程度地变为碎片或原子，其外层电子由于互相碰撞而被激发，当电子由激发态返回低能态或基态时，发射出特征波长的光谱，这种特征的光谱通过经选择的干涉滤光片测量（含有磷、硫、硼、氮、卤素等的化合物均能产生这种光谱）。如硫在火焰中产生350-430nm的光谱，磷产生480-600nm的光谱。检测时通入的氢气量必须多于通常燃烧所需要的氢气量，即在富氢情况下燃烧得到火焰。,3.2.4 质谱检测器(MSD),质谱检测器(mass spectrometry detector, MSD)常用作验证性技术。MSD既可以对复杂样品进行总离子扫描 ,也可以进行选择离子扫描( SIM) , 定量分析一般采用 SIM。,特点：提高分析能力的基础上提供足够的结构信息，用于结构定性。它还可以将在色谱上不能完全分离的共流出物利用时间编程和多通道检测将其完全分开，因此特别适用于分析背景干扰严重、定性困难、样品组分含量低的情况，近年来逐渐被世界各国权威检测机构用于仲裁分析。,工作原理：通过对被测样品离子的质荷比的测定来进行分析的一种分析方法。被分析的样品首先要离子化，然后利用不同离子在电场或磁场的运动行为的不同，把离子按质荷比（m/z）分开而得到质谱，通过样品的质谱和相关信息，可以得到样品的定性定量结果。,3.2.5 火焰电离检测器( FID),火焰电离检测器(flame ionization detector, FID)又称氢火焰电离检测器。其突出优点是对几乎所有的有机物均有响应。 特点：对烃类灵敏度高且响应与碳原子数成正比, 对 H2O、CO2、CS2 等无机物不敏感。因此主要用于水中挥发性极性有机物的痕量分析。,工作原理：它是典型的破坏性、质量型检测器，以氢气和空气燃烧生成的火焰为能源，当有机化合物进入以氢气和氧气燃烧的火焰，在高温下产生化学电离，电离产生比基流高几个数量级的离子，在高压电场的定向作用下，形成离子流，微弱的离子流（10-1210-8A）经过高阻（1061011）放大，成为与进入火焰的有机化合物量成正比的电信号，因此可以根据信号的大小对有机物进行定量分析。,3.2.6 原子发射检测器(MIP - AED),原子发射检测器(atomic emission detector, AED) 具有许多独特的性能和应用。GC-AED对残留农药中的N、S、Cl、Br、I等各元素的选择性通道检测, 不仅能够解决化合物分离问题, 而且还可以立即判断出各种化学物质中的元素组成 ,大大简化了分析程序。GC - AED 的一个重要发展是采用动态顶空分析法作为气相色谱样品引入方法。,工作原理：从气相色谱分离出来的组分进入石英放电管，样品在高能等离子体吸收能量产生化学键断裂，并使其原子激发到较高的电子激发态，当激发态的原子和离子失活转变到较低能级时可给出特征的原子发射光谱，经光栅分光，用光电倍增管或光电二极管阵列器接受信号，其信号在理论上应与元素量呈正比，因此可以用于计算化合物的经验式，为组分定性提供参考。,3.2.7光电离检测器( PID),光电离检测器(photo ionization detector, PID)是近 20 余年快速发展起来的一种高灵敏度、高选择性检测器。常用于饮用水中挥发性芳烃的分析, 且检测限达 0. 0020. 020g/ L, 故有芳烃检测器之称。它利用光辐射使被测组分电离，产生信号，其灵敏度比FID高50-100倍，选择性随光源而异。它是非破坏性的浓度型检测器，现已广泛用于环境保护、工业保健。,工作原理：PID的关键部件是一个能发出特定波长的紫外光光源 （用特殊材料制作的灯泡），将该紫外光束射入一个测试腔，当被测有机挥发性气体由泵抽入该测试腔时，受到紫外光的轰击而发生电离，分裂成带正负电性的二个基团。在测试腔的出口处，装有一对施加了适当工作电压的电极，受到电极电压的吸引，带电基团分别趋向相应电极而形成正比于VOC 浓度的电流。通过测量该电流大小，确定VOC 浓度。分裂的基团经过电极后又重新复合，被抽出测试腔。,3.2.8 电导检测器( ELCD),电导检测器(elect rolytic conductivity detector, ELCD)是对含卤、硫、氮化合物具有高选择性和高灵敏度的电化学检测器,作为元素选择性检测器在农药残留分析中得到了应用。,工作原理：ELCD将从GC柱子洗脱出来的卤素物质,在高温催化微反应器中还原成离子化气体 (HX).载入检测器池中的气态反应产物被溶解在离子化的溶剂中,这将提高此混合物的电解电导.检测器放大这个电导率的瞬间改变,生成的信号比例于原始物质中的卤素的质量.,.中药农药残留量分析的前处理方法,样品在进行色谱法分析以前应进行前处理工作，应尽量使样品中残留的痕量农药提取出来、减少农药的损失以及尽可能去除干扰成分，减少杂质的存在。一般不同的农药有不同的处理方法，选择提取溶剂时应根据相似相溶的原理，如有机制氯农药极性弱，应选用石油醚、正己烷等溶剂，极性较强的农药应选择二氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮等。,3.3.1 提取,有机氯农药： 近年来报道的常用提取方法一般将样品与可与水混溶的有机溶剂如丙酮、乙腈一起混合提取，再用其它有机溶剂如正己烷、二氯甲烷进行液液萃取，将有机氯农药提取后浓缩再净化，其中超声法、振荡法最常见。净化方法主要是在teiwandter基础上建立起来的磺化法，不可采用柱层析净化。,拟除虫菊酯类农药 拟除虫菊酯类农药为亲脂性化合物，目前常用的提取菊酯类农药的溶剂有乙腈、丙酮、丙峒一石油醚，丙酮一正己烷混合溶剂。,有机磷农药 有机磷农药包括六大类，极性差异很大，试图用一