课件：第五节弧菌属.pptx

第五节 弧菌属,弧菌属细菌是一大群菌体短小、弯曲呈弧状的、运动活泼的G-菌。本属细菌目前有36个种，广泛分布与自然界，以水中最多。大多数为非致病菌，关注霍乱弧菌和副溶血性弧菌。 氧化酶试验阳性 有单鞭毛,概述 霍乱弧菌是人类霍乱的病原体,霍乱是一种古老且流行广泛的烈性消化道传染病之一。 两个生物型：古典型霍乱弧菌和ELtor弧菌 曾发生过7次世界性霍乱大流行，病原体均为O1群，前6次古典生物型；第7次是Eltor生物型。主要表现为剧烈的呕吐，腹泻，失水，死亡率甚高。属于国际检疫传染病。 1992年出现新流行菌株O139，首次由非O1群引起，是目前在东南亚各国流行的主要病原菌。,一、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）,历史上的霍乱恐惧,1893年的一天,53岁的柴可夫斯基在彼得堡成功地演出第六交响曲 酒馆去庆贺，口渴，一杯生水 当天夜里,身体不适 发病第四天与世长辞 一代音乐大师倒在了小小的霍乱病菌下 也就成为了一曲“绝唱”,（一）生物学特性 1、形态与染色,取霍乱病人米泔水样粪便作活菌悬滴观察，可见细菌运动极为活泼，细菌呈穿梭或流星样运动； 涂片中，排列整齐，呈鱼群状排列。,革兰氏阴性菌，菌体短小呈弧形或逗点状，大小为1-3m*0.3-0.6m。有单鞭毛、周身菌毛，无芽孢，有些菌株（如O139）有荚膜。经人工培养后，易失去弧形而呈杆状。,Vibrio cholerae,Vibrio cholerae (x 15,575),霍乱弧菌,2.培养特性与生化反应 兼性厌氧，营养要求不高，耐碱不耐酸 最适PH为8.89.0，在碱性琼脂平板上生长后，呈水滴样光滑型菌落，而在碱性蛋白胨液体培养基中，生长迅速，培养68小时即可形成菌膜，利用这一特点，可以作快速增菌，进行鉴定。在庆大霉素琼脂平板上，生长快，810小时能生长出小菌落，可供鉴定用。 因其他细菌在这一PH不易生长，故碱性蛋白胨水可作为初次分离霍乱弧菌的选择培养基，增殖霍乱弧菌。在碱性平板上菌落直径为2mm,圆形，光滑，透明。 能发酵葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、半乳糖等产酸产气，迟缓发酵乳糖。不分解阿拉伯糖、水杨素、卫矛醇、鼠李糖、木糖、侧金盏花醇和肌醇。过氧化氢酶试验阳性、氧化酶阳性、吲哚试验阳性、明胶液化试验阳性。,霍乱弧菌能分解色氨酸产生吲哚，同时能还原硝酸盐为亚硝酸盐。因此当霍乱弧菌培养在含硝酸盐的蛋白胨水中，所产生的亚硝酸盐与吲哚结合成亚硝基吲哚，滴加浓硫酸即出现蔷薇色，称为霍乱红试验阳性。但其他非致病性弧菌亦有此反应，故不能凭此鉴定霍乱弧菌。 EL Tor型霍乱弧菌与古典型霍乱弧菌生化反应有所不同。前者Vp阳性而后者为阴性。前者能产生强烈的溶血素，溶解羊红细胞，在血平板上生长的菌落周围出现明显的透明溶血环，古典型霍乱弧菌则不溶解羊红细胞。个别EL Tor型霍乱弧菌株亦不溶血。,3.抗原构造与分型 1）O抗原（155个血清群）分群依据 O1群，O139群引起霍乱；其它与人类胃肠炎有关。 O1群分3为个血清型（小川型、稻叶型、彦岛型）； O1群表型差异分2个生物型（古典生物型；ElTor生物型） 古典生物型（classical biotype） 不溶解羊红细胞 不凝集鸡红细胞 对多粘菌素敏感 被第IV群噬菌体裂解 El Tor生物型（El Tor biotype） 与古典物型上述性状完全相反 2）H抗原 特异性低,3.抗原构造与分型 霍乱弧菌有耐热的O抗原和不耐热的H抗原。根据O抗原不同，可分为155个血清群，其中OI群、O139群可引起霍乱，O139群与O1群之间在抗原性方面无交叉。其它血清群分布于水源中，可引起人类胃肠炎等疾病。 O1群霍乱弧菌根据其菌体抗原所含3种抗原因子A、B、C的不同，又可分为3个血清型：小川型、稻叶型和彦岛型，其中前两型是造成流行的主要类别。根据生物学表型的差异，O1群霍乱弧菌的每个血清型又可分为2个生物型，即古典生物型和El Tor生物型。,80多个血清型,（不凝集弧菌）,（原型）,（中间型）,（异型）,4.抵抗力 El Tor生物型和其它非01群霍乱弧菌在外环境中的生存力较古典型抵抗力强。 水中存活长，河水、井水、海水中1-3周，在鲜鱼，贝壳类食物上存活12周。 不耐热，耐低温，对一般消毒剂抵抗力弱。湿热55，15分钟，100，12分钟，水中加0.5ppm （0.5ug/mL）氯15分钟可被杀死。 不耐酸，耐碱。在正常胃酸中仅能存活4分钟 1：4比例加漂白粉处理病人排泄物或呕吐物，经1小时可达到消毒目的。0.1%高锰酸钾浸泡蔬菜、水果可达到消毒目的。 霍乱弧菌对链霉素、氯霉素、四环素敏感，对庆大酶素有耐药性。,（二）致病性与免疫性,1.致病物质,（1）鞭毛、黏液素酶 霍乱弧菌的鞭毛有助于细菌穿过肠黏膜表面黏液层而接近肠壁上皮细胞。有毒株可产生黏液素酶，液化黏液，有利于细菌穿过黏液层。 （2）菌毛 普通菌毛的黏附作用可使霍乱弧菌定植于小肠黏膜而致病。,（2）霍乱肠毒素：是目前已知的致泻毒素中最为强烈的毒素，也是肠毒素的典型代表。本质是蛋白质, 不耐热，56经30分钟，即可破坏其活性。甲醛脱毒成类毒素。对蛋白酶敏感而对胰蛋白酶抵抗。该毒素属外毒素，具有很强的抗原性。现已能将该毒素高度精制成晶状，仍保持极强的生物学活性。,霍乱肠毒素致病机理如下 毒素由一个A亚单位和5个相同的B亚单位构成，A亚单位又分为A1和A2两个肽链，两者依靠二硫链连接。A亚单位为CT的毒性活性部分，其中A1肽链具有酶活性，A2肽链与B亚单位结合参与受体介导的内吞作用中的转位作用。B亚单位为结合单位，能特异地识别肠上皮细胞上的受体。 霍乱肠毒素作用于肠细胞膜表面上的受体（由神经节苷脂GM1组成），其B亚单位与受体结合，使毒素分子变构，A亚单位进入细胞，A1肽链活化，进而激活腺苷环化酶（AC），使三磷酸腺苷（ATP）转化为环磷酸腺苷（cAMP），细胞内 cAMP浓度增高，导致肠粘膜细胞分泌功能大为亢进，肠黏膜上皮细胞主动分泌钠离子、钾离子、碳酸氢根离子和水，使大量体液和电解质进入肠腔而发生剧烈腹泻与呕吐，由于大量脱水和失盐，可发生代谢性酸中毒，血循环衰竭，甚至休克或死亡。,霍乱肠毒素的作用机制,Department of Microbiology, Harbin Medical University,Department of Microbiology, Harbin Medical University,B亚单位 与小肠粘膜 上皮细胞 GM1神经节苷脂受体结合,cAMP水平升高 肠上皮细胞主动分泌Na+、K+、HCO3 和水 肠腔大量积液，导致严重腹泻和呕吐,Department of Microbiology, Harbin Medical University,典型病例：吞食细菌后2-3d突然出现剧烈的腹泻和呕吐，严重病例每小时失水量可高达1L，腹泻物呈米泔样。,2.所致疾病 烈性肠道传染病-霍乱，我国甲类法定传染病 人类在自然情况下是霍乱弧菌的唯一易感者 传染源-患者和带菌者 通过污染食物或水源经口传染，一般情况被胃酸杀灭，胃酸减少时可进入小肠。在一定条件下，霍乱弧菌进入小肠后，依靠鞭毛的运动，穿过粘膜表面的粘液层，可能藉菌毛作用粘附于肠壁上皮细胞上，在肠粘膜表面迅速繁殖，经过短暂的潜伏期后便急骤发病。该菌不侵入肠上皮细胞和肠腺，也不侵入血流，仅在局部繁殖和产生霍乱肠毒素，此毒素作用于粘膜上皮细胞与肠腺使肠液过度分泌。 临床表现：上吐下泻：典型病例一般在感染后23小时突然出现剧烈腹泻和呕吐，多无腹痛，每天大便数次或数十次。在疾病最严重时，每小时失水量可高达1升，排出由粘膜、上皮细胞和大量弧菌构成的如米泔水样的腹泻物。 死亡原因：由于大量水分和电解质丧失而导致失水，代谢性酸中毒，低碱血症和低容量性休克及心力不齐和肾衰竭，如未经治疗处理，病人可在1224小时内死亡，死亡率高达25%60%，但若及时给病人补充液体及电解质，死亡率可小于1%。O139群霍乱弧菌感染比O1群严重，表现为严重脱水和高死亡率，且成人病例所占比例较高，大于70%，而O1群霍乱弧菌流行高峰期，儿童病例约占60%。 病愈后一些患者可短期带菌，一般不超过34周，真正的慢性带菌者罕见。病菌主要存在于胆囊中。,霍乱病人,2019/8/25,25,可编辑,Department of Microbiology, Harbin Medical University,“米泔水”样便及霍乱患儿,3.免疫性 机体感染霍乱弧菌后可获得牢固免疫力，再感染少见，病人在发病数日，血液中即可出现特异性抗体，714天抗体滴度达高峰，随后逐渐下降至较低水平，但能持续约3个月之外。 主要是体液免疫，包括肠毒素抗体（抗B亚单位）、抗菌抗体（抗O抗原）、肠道黏膜表面的SlgA，但抗O1群霍乱弧菌的免疫力对O139群霍乱弧菌无交叉保护作用。,（三）微生物学检查 取病人粪便或呕吐物，涂片染色镜检见革兰阴性弧菌，用悬滴法观察细菌呈穿梭样运动，加入霍乱抗血清后运动消失，即为制动实验阳性，可做出初步诊断。进一步检测可做细菌的分离培养和鉴定。荧光抗体法、协同凝集试验、PCR等可用于霍乱的快速诊断。,1.标本 病人米泔水样粪便或呕吐物,2.直接镜检 显微镜下检测： 1、革兰氏染色试验：霍乱弧菌为革兰氏染色阴性，无芽孢，弧形或弯曲状，呈鱼群状排列； 2、动力试验（压低法或悬滴法观察）：将可疑菌落接种在一管APW，在37 1 培养1h-6h。滴一滴菌悬液于一干净的载玻片上，盖上盖玻片，镜下检查细菌运动性，霍乱弧菌培养物应为运动性阳性，细菌呈穿梭样运动。,3.分离培养 可将材料接种至碱性蛋白胨水37培养68小时后，取生长物作形态观察，并转种于碱性平板作分离培养，取可疑菌落作玻片凝集，阳性者再作生化反应及生物型别鉴定试验。 增菌：碱性蛋白胨水 （1）第一次选择性増菌：以无菌操作称取25g样品，放入装有225ml灭菌碱性蛋白胨水（APW）増菌液的均质杯内，于8000r/min-10000r/min静置1min-2min,或以剪刀充分剪碎，制成1：10样品均液，深冻样品、干品、盐渍产品的初始増菌夜放置在37 1 培养61h，新鲜样品的初始増菌放置在41.5 1 培养61h。 如果样品不够25g，则取全部样品，加入9xml増菌液以获得10-1浓度的样品均液 如果上述制备的待验样品不能够在当日进行培养，应放置在2-8 保存至次日 注：加入样品前，APW应遇见保温至371摄氏度 （2）第二次选择性増菌：从步骤1中去1ml培养物接种到10ml的APW中，至于41.51摄氏度培养181h,3.分离培养 分离：TCBS选择培养基 分别用直径为3mm的接种环从步骤1和步骤2的APW増菌液中蘸取一接种环，划线接种TCBS琼脂在371 培养箱中将平板倒置培养。 经过24h3h培养后，检查平板有无可疑菌落。在平板的背面标记可疑菌落。霍乱弧菌在TCBS上的可以菌落形态为：表面光滑，黄色，直径约为2mm-3mm.,4.鉴定： （1）选择可疑菌落并纯化菌落：至少应挑取5个可疑菌落，进行传代培养。如果平板上的可疑菌落少于5个，则应该全部挑取传代培养。 在氯化钠营养琼脂平板或试管斜面接种单个可疑菌落进行传代培养以获得纯培养物。在37 1 培养箱中培养24h 3h ，对氯化钠营养琼脂上的纯培养物进行鉴定。,氧化酶试验：以无菌白色滤纸蘸取营养琼脂表面纯培养物，滴加氧化酶试剂进行氧化酶试验。如果滤纸颜色在10s内变为紫色或者深紫色，则为阳性反应。,氯化钠三糖铁试验：接种氯化钠三铁糖斜面，穿刺底层并划线斜面。 37 1 培养箱中培养24h 13h 。 反应结果 琼脂底层 黄色：葡萄糖发酵反应阳性 红色或未变色：葡萄糖发酵反应阴性（不发酵葡萄糖） 黑色：产生硫化氢 产生气泡或培养基爆裂：葡萄糖发酵产气 琼脂斜面 黄色：乳糖或蔗糖阳性（利用乳糖或蔗糖） 红色或未变色：乳糖或蔗糖阴性（不利用乳糖或蔗糖） 可疑的霍乱弧菌在氯化钠三铁糖斜面上的反应为底层黄色，斜面黄色，不产生硫化氢，不产气。培养应不超过24h（斜面的黄色可能在24h后变为红色）,5.快速诊断 免疫荧光试验 除一般免疫荧光法外，还可用荧光菌球法检查。 协同凝集试验,（四）防治原则 必须贯彻预防为主的方针，加强国境检疫，严防本菌传入，此外应加强水、粪管理，注意饮食卫生。对病人要严格隔离，必要时实行疫区封锁，以免疾病扩散蔓延。 人群的菌苗预防接种，可获良好效果，现用加热或化学药品杀死的古典型霍乱菌苗皮下接种，能降低发病率。这种苗菌对EL-Tor型霍乱弧菌感染也有保护作用，但持续时间短，仅3-6个月。目前有新型的口服rBS/WC疫苗(重组B亚单位/霍乱菌体疫苗)可用于预防霍乱，2000年WHO关于霍乱疫苗的意见书提出，“应考虑对有罹患霍乱危险性的人群使用rBS/WC疫苗“。该疫苗对霍乱的保护期为3年。治疗主要为及时补充液体和电解质及应用抗菌药物如链霉素、氯霉素、强力霉素、复方SMZ-TMP等。,二、副溶血性弧菌 主要引起食物中毒，是我国沿海地区食物中毒最常见的一种 病原菌。该菌引起的食物中毒经烹饪不当的海产品或盐腌制 品传播。临床表现：腹痛、腹泻、呕吐和低热。水样粪便， 但恢复较快。该菌具有嗜盐性。,（一）生物学特性,1.形态与染色 革兰阴性菌，随培养基不同菌体形态差异较大，有卵圆形、棒状、球杆状、梨状、弧形等多种形态。两极浓染。菌体一端有单鞭毛，运动活泼。无芽胞、无荚膜。,2.培养特性 需氧，营养要求不高 嗜盐，在3.5%的氯化钠培养基中、PH7.7及37的条件下生长良好，菌落边缘不整齐，凸起、光滑湿润，不透明；在无盐培养基中不生长。 在液体培养基表面形成菌膜。 在副溶血性弧菌专用选择培养基上形成12.5mm，稍隆起、混浊、无粘性、绿色菌落； 在SS平板上不生长或长出12mm扁平无色半透明的菌落，不易挑起，挑起时呈粘丝状医学教育网搜集整理。 在羊血琼脂平板上，形成23mm、圆形、隆起、湿润、灰白色菌落，某些菌株可形成溶血或溶血，即神奈川现象。 在TCBS琼脂上不发酵蔗糖，菌落绿色。（与霍乱弧菌相区别）,3.生化反应 本菌在30gLNaCl和70gLNaCl培养基中生长，在无盐或100gLNaCl培养基中不生长。神奈川试验是致病菌株能使人或兔红细胞发生溶血，对马红细胞不溶血，称神奈川试验阳性。,4.抵抗力 本菌不耐热，90C1分钟即被杀死，不耐冷，不耐酸，50%食醋中1分钟死亡，对常用消毒剂抵抗力弱。生长所需pH为7.09.5，最适pH为7.7.,（二）致病性与免疫性,1.致病物质 致病因子有粘附因子（主要为菌毛）、毒素（如耐热性溶血素）。,2.所致疾病,食物中毒及急性胃肠炎 传播途径：烹饪不当的海产品、盐腌制品或生熟不分所传播 潜伏期572小时，可从自限性腹泻至中度霍乱样病症 免疫性：病后免疫力不强，可重复感染 该菌还可引起浅表创伤感染、败血症等,临床表现,潜伏期自1小时至4天不等，多数为10小时左右。起病急骤，常有腹痛、腹泻、呕吐、失水、畏寒及发热。腹痛多呈陈发性绞痛，常位于上腹部、脐周或回盲部。腹泻每日320余次不等，