课件：慢性疼痛基因治疗的研究现状和展望.ppt

,研究现状与展望,第二军医大学东方肝胆外科医院 俞卫锋,慢性疼痛的基因治疗,今日主题,慢性疼痛的概念与机制 寻找慢性疼痛治疗新方法的迫切性 慢性疼痛的基因治疗的研究 基因治疗希望与困难并存,慢性疼痛的概念与机制,定义,慢性疼痛 指在引起急性疼痛的因素消退以后仍然持续存在的疼痛，或伴随慢性原始病程产生的疼痛，诸如创伤或损伤、偏头痛、各类关节炎、血管神经疾病和癌症的伴随症状。,疼痛反应对于生物体和生存是一把双刃剑，在应激过程中使生物体能够趋利避害，做出保护自身的反应，而当疼痛的程度过强或者其持续时间较长，机体内则将产生一系列反应使机体的内环境发生变化，而不利于正常生存。,疼痛治疗的现代观念 疼痛是一种疾病 疼痛永远是恶性的，需要治疗 疼痛是伤害性或潜在组织损伤引起的不愉快感觉，常伴有内分泌、代谢、免疫和精神心理改变,慢性疼痛它不仅给病患者带来了难以忍受的痛苦，同时也给社会的发展和家庭的和谐增添了无形的阻力。已成为危害公共健康一大问题。,慢性疼痛 危害性与普遍性,慢性疼痛的分类,神经性痛 传递疼痛信号过于强烈，机体产生不适应 炎性痛 机体内的某些物质（炎性因子或炎性介质）过多，不断地刺激产生痛觉的感受器，使人体感受到痛 癌痛 既有神经性痛也有炎性痛的的特殊类型,疼痛传递的感受,致痛因子如热、冷、机械压力、化学物质等作用于疼痛感受器（分布于全身的特殊的感觉神经末梢）。,不同直径的初级传入神经元 伤害刺激和其感受器特异性激活后产生的疼痛信号经过不同的初级传入神经传到不同区域的脊髓背角。初级传入神经元有不同的直径，根据直径的大小可分为三大类，分别传递不同的信息。,初级传入神经元,本体觉轻触觉,定位明确的伤害性刺激,定位模糊的伤害性刺激,疼痛上传通路,脊髓背角,背根神经节,脊髓丘脑束,大脑皮层产生感知定位,内源性镇痛系统,内源性镇痛系统： 1、下行抑制旁路： 5HT; 去甲肾上腺素纤维对传导疼痛的上行旁路有一定抑制作用。 2、内源性吗啡肽： 内啡肽和脑啡肽等与上行旁路突触周围的阿片受体结合，阻断兴奋性递质的释放，降低痛觉。,疼痛的敏化机制,中枢敏化外周敏化,外周敏化,中枢敏化,癌症（WHO统计） 全球年新发癌症患者1000万，40%伴有不同程度的疼痛； 60%90%的晚期癌症患者有不同程度的疼痛，70%以疼痛为主要症状 全世界至少有500万人忍受着癌症疼痛的折磨 我国每年癌症新发病人数约有180万，其中62伴有疼痛,癌痛的危害性,疼痛不仅是一个医学问题，逐渐变成了一个社会性问题,现有疼痛治疗的局限性,药物治疗,非甾体抗炎药（NSAID） 潜在的心血管风险 阿片类药物 耐受与戒断,现有药物性、神经阻滞、物理、心理、中医、手术治疗等治疗方法,神经阻滞,指在末梢的脑、脊神经（或神经节）、交感神经节等神经内或神经旁注入药物或以手术物理方法阻断神经传导功能 需要在短期内重复治疗及影响神经的功能,脊髓刺激,通过放置硬膜外电极，提供电刺激作用于脊髓后根称脊髓刺激（Spinal Cord Stimulation，SCS） 物理、心理、中医等治疗,解除疼痛的机理尚不十分清楚，疗效不确切,虽然使用这些药物和方法确实能产生好的镇痛效果，但伴随而来的是一些令人忧虑的副作用,药物治疗给人们和社会带来的后期效果是复杂的，人们越来越意识到化学药物治疗的缺陷，寻找一种先进并且治疗效果好的方法是慢性疼痛治疗中非常迫切的课题。,两种治疗方法的比较,慢性疼痛的基因治疗的研究,什么是基因治疗？,基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷，从而达到治疗疾病目的的生物医学新技术。 DNA ？ 疾病,基因治疗的标靶与范围,基因治疗的靶细胞主要分为两大类：体细胞和生殖细胞。 目前开展的基因治疗只限于体细胞。基因治疗目前主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾病。包括：遗传病（如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病（如AIDS、类风湿等）。,基因治疗的起始,1989年 美国Rosenberg等经美国FDA批准，进行了标志基因转移到人体的首次临床试验。 1990年11月 美国NIH的Blease，Culver和Anderson进行了首例人体基因治疗的临床试验，并取得了巨大的成功。,基因治疗的研究现状,基因治疗在经历了准备期、狂热期后，从1996年进入了理性期。美国成立了三个研究基因导入系统与载体的研究机构 ； 从1996 年至今，全世界的基因治疗临床方案增加了数倍，参加治疗的病人数也有相应增加。从投资来看，除国家投资外，企业界的热情有增无减，目前每年的总投资在20亿美元左右。这些都说明基因治疗研究已经以稳健的步伐跨入了二十一世纪！,到2005年1月止基因治疗,迄今共有1020个方案进入临床试验。其中方案主要集中在美洲和欧洲，各有682和288个。 美国最多，有669个方案。我国数量较少，仅有3个方案。 针对癌症的治疗仍是基因治疗的首选目标，但其所占比重相对于1996年的统计已经有所下降。,基因治疗临床方案,采用的基因导入系统 目前在基因治疗中所采用的基因转导系统主要有反转录病毒载体、腺病毒载体、裸DNA、脂质体和腺相关病毒载体等，其中腺病毒载体和反转录病毒载体占绝大部分，分别有 260和261个方案采用，而腺相关病毒载体只有27个，可能是由于腺相关病毒的生产仍有待突破。,治疗基因 选择主要集中于抗体、肿瘤抑制剂和细胞因子三个方面。,基因治疗要取得实质性的突破，必须解决三个关键问题，即基因导入系统、基因表达的可控性及治疗效果明确的治疗基因。,慢性疼痛基因治疗可行吗？,答案是肯定的！,单次治疗持续时间显著延长,内源性基因产物不易耐受成瘾,产物对正常神经系统功能影响小,疼痛基因治疗的策略,上调抗痛基因表达 利用基因重组技术将一些抗痛基因、调控因子基因及受体基因等外源基因插入载体基因组，加上启动子，导入神经细胞，促进抗痛基因的表达。 下调疼痛基因表达 降低神经系统内源性疼痛分子的表达，目前基因治疗中常用的knockdown技术有反义寡核苷酸技术(antisense oligonucleotide,as0DN)和RNA干扰(RNAi)。,上调抗痛基因表达,常用目的基因 主要是阿片肽基因,神经营养因子家族：是一类能够促进特定神经组织细胞分化、再生，刺激神经递质释放并且能改变神经元特性的蛋白分子，包括NT3、NT4、 BDNF、NGF等。主要是通过抑制神经元凋亡和促进阿片肽释放治疗疼痛，适用于神经损伤或中毒导致的慢性神经痛。 免疫调节性细胞因子：IL-2和IL-10。其中前者主要通过类阿片肽作用，后者通过抑制神经组织炎症反应达到镇痛目的。,其他目的基因主要是细胞因子,脑啡肽基因治疗实验报导,1999年，Eaton M J 等将前脑啡肽原基因构建到第一代人单纯疱疹病毒基因组中，通过小鼠足底皮肤注射感染脊髓后角神经元，高效表达的脑啡肽明显抑制小鼠的冷热刺激痛阈，治疗持续时间达3个月。 2001年，Braz J等报导用前脑啡肽原基因治疗关节炎性痛模型。 2003年，Goss J R 等报导重复注射这种基因治疗系统治疗慢性神经痛模型，并无明显的耐受发生。,-内啡肽基因治疗实验报导,1995年Beutle A S.等将小鼠神经生长因子前导肽与内啡肽编码基因的融合，以逆转录病毒为载体转染NIH3T3 细胞，培养基中可检测到高浓度的内啡肽 1999年Alan A. Finegold等 采用这种融合基因重组的非增殖型腺病毒，大鼠脑脊液内注射后，三天后脑脊液中的内啡肽的浓度达到正常大鼠和人脑脊液中内啡肽浓度的10-20倍，能够有效地抑制炎性痛觉过敏 2003年，我们构建携带这种融合基因的腺病毒，观察到对大鼠坐骨神经痛具有显著的镇痛效果,转基因蛋白定量检测,大鼠脑脊液-内啡肽含量变化趋势,-内啡肽基因治疗CCI模型,CCI大鼠转基因治疗热痛阈变化趋势图,常用的转基因载体,病毒载体：转染效率高，转基因表达稳定 单纯疱疹病毒：神经毒性大 腺相关病毒：制备困难，装载容量小，起效慢 逆转录病毒：不能感染非分裂细胞，致畸、成瘤 腺病毒：安全、易制备，宿主范围广，可感染处于不同 周期的细胞 非病毒载体：转染率低，表达不稳定 细胞载体、脂质体、裸DNA、真核表达载体等,基因载体系统,病毒载体系统,非病毒载体系统,腺病毒载体,反转录病毒载体,腺相关病毒载体,单纯疱疹病毒载体,慢病毒载体,裸DNA,DNA-阳离子脂质复合物,DNA-蛋白质复合物,细胞内包装,细胞外包装,DNA-阳离子多聚物,DNA/RNA嵌合物,优点：1、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高； 2、复杂的装配过程由细胞完成； 3、不同的病毒载体具有不同的表达特点。,病毒载体系统,细胞毒性 染色体毒性 免疫毒性,存在的问题1、安全性 2、靶向性 3、有效性,转导靶向性 转录靶向性,转导效率 基因表达水平和持续时间 表达的可调控性,2019/8/31,42,可编辑,腺病毒,生物学特性： 双链DNA病毒，优点是能感染分裂和非分裂细胞，高滴度制备容易，对人体的毒害作用轻微。缺点是免疫源性强，目的基因表达时间短。,腺病毒结构,腺病毒基因组示意图,腺病毒转移载体优点,1) 安全 2) 宿主范围广 3) 感染性强 4) 人类蛋白可获得高水平表达 5) 稳定性比较好 6) 易于制备与纯化 7) 制备的病毒滴度高 8) 可通过多种方式到达中枢神经系统,腺病毒载体的缺点及改造,缺点：1) 载体容量有限（约8kb) 2)宿主强烈的免疫反应和细胞毒性 3) 基因表达时间短暂,改造方向： 剔除病毒基因组，保留包装所需基因组分，获得的二三代腺病 毒的免疫源性将显著降低，能有效延长目的基因的时效。 通过外壳蛋白改造，使病毒对特异组织的亲和力不断提高,有效保证转基因的效率。 利用整合病毒如AAV和逆转录病毒的相关元件与腺病毒基因组重组构建的嵌合病毒，有效整合人体染色体，保证目的基因的长期表达,三代腺病毒载体,第一代：缺失的腺病毒基因片段是E1和/或E3区，属于一类复制缺陷、非辅助病毒依赖型载体 第二代：在第一代的基础上，用温敏突变子控制E2A基因产物DBP的表达，进一步缺失E2区和/或E4 第三代：即Gutless Vector, mini-Ad，仅含有病毒DNA两端的反向末端重复序列，中间夹有transgene，但至今仍处于研制阶段,TR,TR,Transgene cassette,改造 腺病毒基因组,第三代腺病毒生产系统,Ref：Packer M et al., J Refract Surg. 2002 Nov-Dec;18(6):692-6,继承了第一代腺病毒载体的优点 可装载容量大大增加(36Kb) 机体免疫反应和细胞毒性降低 表达时间延长,优点：,腺相关病毒,生物学特性： 微小病毒科，优点是有效整合宿主细胞染色体，可同时表达多 个目的基因，免疫反应轻，转基因表达时间长达6个月以上。 缺点是插入区小，最大只能插入4-5Kb的片段，制备时需要辅助 病毒，易含有野毒，而且高滴度制备困难。整合基因可能导致宿 主基因突变从而引起癌变 研究方向： 高滴度和高纯度制备技术 制备嵌合病毒 长期基因治疗安全性,腺相关病毒包装过程示意图,rAAV的生产原理,单纯疱疹病毒,生物学特性： 双链DNA病毒，最大的优点是嗜神经性，外周皮肤或粘膜转染 该病毒后，感染神经末梢，通过轴突运输机制进入神经元胞浆。 缺点是神经毒性大，病毒蛋白可以导致神经元裂解。 研究方向： 多IE（即刻早期）基因剔除株（ICP4-：ICP22-：ICP27-） 的制备，这种复制缺陷病毒的毒性和免疫源性比单基因剔除株 弱，而神经亲和力并不受影响。 利用疱疹病毒的潜伏期启动子作为基因表达启动子，可以获得 长效表达,其他病毒载体,逆转录病毒： 第一种应用于临床病人治疗的病毒就是逆转录病毒，用于ADA缺乏导致 的先天性免疫缺陷病人。逆转录病毒的一个缺点是病毒不能感染非分裂 细胞如神经元细胞，此外它的整合是随机，并不能作到定点整合，因 此，有可能受到基因组的干扰而出现转染沉默现象 。 艾滋病病毒：属于慢病毒类，转基因表达时间长。 动物病毒： 某些动物病毒经过改造后，人体对其不产生免疫应答，从而获得长效 基因表达,非病毒载体简介,细胞载体： 最早的细胞移植载体选用的是人的或牛的肾上腺嗜铬细胞，依靠嗜 铬细胞本身具有分泌儿茶酚胺类物质。 以后发展了采用不死细胞作为载体，通过基因克隆技术使这种细胞 可以分泌阿片肽、GABA或儿茶酚胺。 考虑到宿主抗外源细胞免疫反应对细胞移植的影响，采用生物材料 将细胞微囊化，将细胞的抗原隐蔽起来，降低了免疫反应的程度。 脂质体、基因枪、真核表达载体等： 共同的特点是基因转染效率低下 ：,非病毒载体基因治疗,优点 低毒、低免疫反应、外源基因整合几率低、无基因插入片断大小限制，以及使用简单、制备方便、便于保存和检验 缺点 导入效率低，且无靶向性,概念 将一些特殊细胞植入到受者的中枢神经系统，通过这些类似于“生物微泵”（bio-minipump）的细胞持续分泌镇痛物质而缓解疼痛或提高痛阈。,细胞载体,细胞移植治疗慢性疼痛方法学,主要手段 将一些特殊的细胞（如嗜铬细胞等）移植于中枢神经系统的疼痛调控靶位，移植的细胞如同一个“分泌泵”，可以持续地分泌具有镇痛作用的活性物质 细胞来源 来源于肾上腺髓质的嗜铬细胞和经基因工程改造或修饰过的其它各类细胞,细胞移植治疗慢性疼痛实践,把分离纯化好的嗜铬细胞注射到腰段蛛网膜下腔，发现有助于改善神经痛模型的大鼠以及皮下注射福尔马林的炎性痛模型的大鼠的痛行为 国内利用海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微胶囊包裹纯化的牛嗜铬细胞进行大鼠蛛网膜下腔移植，取得了良好的实验结果,存在的问题 细胞来源较少、体外培养难以获得较高的细胞浓度、细胞分泌镇痛物质的量及其存活时间和安全性较为有限 解决方法 生物细胞永生化和去永生化技术 建系细胞和基因工程修饰细胞的建立,细胞移植治疗慢性疼痛,是利用基因转移技术将外源性的永生化基因如猿病毒40大T抗原（SV40Tag）转入到靶细胞或稳定整合到靶细胞基因组中，获得稳定表达的转化细胞，从增殖危机中逃逸，从而获得类似癌细胞的无限增殖能力，进而建立永生化细胞株。,生物细胞的永生化,在获得具有分裂活性而又无复制衰老的原代永生化细胞后，通过Cre-loxP重组酶系统将两翼“锚定”有loxP序列（LoxP-Flanked）位点的SV40Tag基因定向敲除，使细胞去永生化,从而消除致瘤性，此技术又称为“可塑性永生化”。这一系统意味着可通过这一“基因开关”有目的地控制基因的表达。,生物细胞的去永生化,采用基因工程修饰技术建立具有表达人脑啡肤的永生化和可诱导去永生化的神经前体细胞系是细胞镇痛中细胞来源的最理想的选择。因其植入受者的蛛网膜下腔具有多分化潜能、较好的稳定性、可控性、安全性以及组织相容性和长时间表达镇痛蛋白的效果。,建立可靠安全的镇痛细胞库,下调疼痛基因表达,反义核苷酸,定义： 是指能够通过碱基互补与靶RNA（主要是mRNA）特异结 合，抑制靶RNA的功能，从而控制其表达的一类小分子转录物。 因此，它是通过下调某种基因产物来发挥作用。 作用原理： 在复制水平上，作为DNA复制的抑制因子，与引物RNA前体结 合， 抑制DNA的复制 转录水平上与mRNA 5端结合阻断转录进行。 在翻译水平上与mRNA编码区（主要是起始密码）或非翻译区结合， 直接或间接抑制翻译。 影响前mRNA的剪接或阻止mRNA的成熟和转运。 与mRNA结合，促进mRNA的降解。,反义核苷酸靶基因,靶基因： 主要是参与痛觉传导的中枢神经递质的受体或蛋白的编码基因，这些基因的产物直接或间接导致慢性疼痛病人神经元的高敏现象。 种类： PKC-y 蛋白 NMDA 受体 外周钠通道蛋白 大麻醇受体 乙酰胆碱M型和N型受体 神经激肽（NK）1受体 P物质受体（SPR）,反义核苷酸的优点和不足,优点： 基因克隆简单：片断小，一般为1530bp，可以用DNA自动合成仪大量合成 抑制靶基因的效率高：一个反义分子可以促进多个mRNA的降解，同时在细胞中能够自我扩增，放大抑制效应。 缺点： 在体细胞内不稳定，容易被核酸酶消化 非特异性结合：容易与非互补链结合或与其他小分子物质如蛋白结合 降解产物对细胞的增殖或分化有抑制作用,RNA干扰（RNAi）,定义：双链RNA对基因表达的阻断作用 作用机理： 通过一种小片段干扰性双链RNA作为效应分子催化与靶基因mRNA结合的级联反应而减少mRNA的含量，实际上就是通过细胞內的PCR反应大量扩增干扰性RNA干扰目的基因的表达。主要通过正义链干扰。 研究进展： 非脊椎动物如线虫，果蝇，以及植物中的应用已经取得了很多重要的成果，但在哺乳动物中的应用还处于起步阶段，在哺乳动物身上还没有成功的实验报道。,神经系统基因治疗转染途径,即基因转染的靶向性问题 外周皮肤或粘膜注射： 距离远，转染率低，以神经元为靶细胞 神经核团定点注射： 操作复杂、定点困难、创伤大。以神经元为靶细胞 脑脊液内注射： 类似于临床硬膜外镇痛，这种方法转染效果确实，操作方便，大多以神经元周边的脑膜细胞为靶细胞。,转基因表达效率和疗效研究,目的：转染基因后细胞能够高效、特异、长期的表达产物 策略： 改造转基因载体：剔除即刻早期基因组；改造外壳蛋白，提高对宿主细胞的亲和力。 选用特殊基因调控元件：选用高效启动子或神经元特异启动子，增加转染基因在神经元细胞内的表达 抑制宿主免疫反应：神经系统内主要是抑制细胞免疫反应,基因调控元件的选择,强力启动子： 在多种细胞内都能高效促进基因表达，不具有细胞选择性，因此，在载体不能进入神经元胞浆内时，只能通过周边细胞以旁分泌形式表达产物。例如RCMV和HCMV启动子,靶向性启动子和调控元件： 只能在特异的细胞內如神经元内启动基因表达，在外周组织内不表达，以自分泌形式发挥作用。例如人synapsin-1 基因启动子，大鼠特异烯醇酶(NSE)启动子，神经元特异的沉默子元件（NRSEs） 可诱导性启动子： 通过药物诱导启动子功能达到调控基因表达的目的。目前常用的有四环素（Tet on/off）系统、利福平调控系统等。,基因调控元件的选择,基因治疗疗效观察,动物模型 慢性炎性痛模型： 福尔马林、鹿角菜胶、辣椒素炎性痛和福氏佐剂性关节炎模型 慢性神经痛模型：