课件：ALENs的靶向基因修饰技术易懂版.ppt

TALENs的靶向基因修饰技术 TALENs-transcription activator-like effectors nucleases,简介,Cas9,锌指核酸酶技术 (ZFN),转基因技术,RNAi技术,生物应用模型构建,基因组靶向修饰,（TALENs）,普通的基 因敲除,什么是基因敲除？,是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物（表型），推测相应基因的功能。 基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术。,基因敲除的技术基础,1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。此后的几年中，基因敲除技术得到了进一步的发展和完善。,基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。,交叉互换,基因敲除的技术基础,利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤,TALEN基因敲除技术,TALEN（ Transcription Activator-Like Effector Nucleases ） 转录激活子样效应因子核酸酶, 科学家发现天然的TALENs最初是由黄单胞菌进入植物细胞分泌的，将它应用于基因修饰方面，使它成为了一种崭新的分子生物学方法. TALENs技术特点：1. 无基因序列、细胞、物种限制。 2. TALE的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应关系。实验设计 简单准确、实验周期短、成本低。 3. 成功率几乎可达100%。 毒性低、脱靶情况少。 4. 克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的活性。,TALEN基因敲除技术,每周,技术原理,TALEN基因敲除技术,2019/9/1,10,可编辑,TALEN基因敲除技术,TALE蛋白能识别并结合特异的 DNA 序列， Fok I 则可通过二聚体化产生核酸内切酶活性, 从而在特定的位点切断DNA序列，造成 DNA 的双链断裂(Double-stand break, DSB)。,TALENs结构,TALE蛋白的DNA结合结合域,Fok I 核酸酶的切割结构域,TALENs结构的构建,TALE模块识别DNA的机制在于不同的双连氨基酸残基（VD）能够特异地分别识别A、T、C、G 4 种碱基中的一种。 通过对天然TALE 的研究发现，有20多种不同的VD可以特异性的识别碱基，其中 Asn /Ile( NI)识别碱基A; His /Asp( HD)识别碱基C; Asn/Gly(NG)识别碱基T; Asn /Asn( NN)识别碱基G/A。 VD 的第1 位氨基酸与蛋白质骨架结合，起到稳定VD 的作用; 第2 位氨基酸则直接与DNA 的碱基特异识别,TALENs结构的构建,TALE是由12和13以上特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成。每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，第12和13位双连氨基酸残基 (RVDs)是靶向识别的关键位点，TALEs上的每个RVDs仅能识别一个碱基,这样就产生了一连串的识别序列。,TALENs结构的构建,TALENs结构的构建,将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含有TAL的其它必需结构域并在C端融合有FokI序列。 目前，TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因。因FokI需形成2聚体方能发挥活性，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔17碱基）的靶序列（14 - 18个碱基）分别进行TAL识别模块构建。,TALENs的作用机制,将TALEN质粒对共转入细胞中可实现靶基因敲除。TALEN质粒对共转入细胞后，表达的融合蛋白，分别与靶位点特异结合， 由于两个TALEN融合蛋白中的FokI临近， 形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA， 形成DSB（Double-Strand Breaks），诱发DNA损伤修复机制。细胞可以通过非同源末端结合（NHEJ）修复DNA， 在此修过程中或多或少地删除或插入了一定数目的碱基，造成移码，形成目标基因敲除突变体。,TALENs基因靶向修饰技术的应用,建立生物模型。 在基因功能，代谢途径等研究中模型生物的建立非常重要。基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。最常见的是小鼠、线虫、酵母，斑马鱼等的基因敲除模型也常见于报道。 疾病的