课件：肿瘤诱导分化治疗原理及临床应用.ppt

肿瘤诱导分化治疗的原理及临床应用,血液肿瘤科 王华,长期以来，“细胞一旦癌变后，就永远是癌细胞”的观点一直统治着肿瘤学领域，即恶性肿瘤是不能逆转的。 1971年，Friend报告小鼠红白血病细胞（MEL）可被二甲基亚砜（DMSO）诱导分化，开创了肿瘤细胞分化研究的先河。,细胞分化与肿瘤,一、肿瘤细胞诱导分化的有关概念,1. 分化(differentiation） 细胞分化是指幼稚的胚胎细胞生长发育为各种不同形态结构和功能代谢的成熟细胞的过程。如人起源于一个受精卵，通过细胞分裂形成内、中、外三个胚层细胞。,2. 反分化 (retro-differentiation) 又称去分化(dedifferentiation)，肿瘤的反分化是指细胞恶变后，细胞的多种表型又回到胚胎细胞表型的现象。恶性肿瘤细胞表现分化异常，不成熟。,3.再分化（redifferentiation） 又称逆转（reversion），它是指在分化诱导剂的作用下，恶性肿瘤细胞被诱导而重新向正常细胞的方向演变分化，表现为形态学、生物学、生物化学等诸多指标均向正常细胞接近，甚至完全转变为正常细胞。,二、分化诱导剂,1.内源性分化诱导剂 内源性分化诱导剂是由肿瘤或宿主细胞产生的具有分化诱导作用的化学物质。它有以下几种： 集落刺激因子（CSF）：分为CSF-M和CSF-G； 粒细胞巨噬细胞分化因子（GMDF）； 类固醇类化合物：如糖皮质激素和1，25-（OH）2-vitD3； 细胞因子:如TNF-和INF-； 糖脂:如神经节苷脂GM3； 其它，如cAMP等。,2.外源性分化诱导剂 可分为以下几类： 无机化合物：亚硒酸钠等。 简单的有机化合物：正丁酸、二甲基亚砜(DMSO)、六亚甲基二乙酰胺(HMBA)等。 维生素A类化合物：维甲酸、AM80、芳维甲等。 佛波酯类化合物：12-O-十四酯酰佛波-13-乙酸(TPA)。 抗生素类：放线菌素D、丝裂霉素等； 抗癌药：6-巯基嘌呤、5-氮胞嘧啶等。,三、诱导肿瘤分化的研究,1.体外分化诱导模型 (1)白血病细胞分化诱导模型 急性髓性白血病细胞株HL-60： 形态:分化为中、晚幼粒、杆状核细胞和分叶核细胞； 生化:出现硝基蓝四氮唑还原性（NBT）； 功能:出现吞噬活性及趋化性； 生物学:丧失了在软琼脂培养基上形成集落及裸鼠体内移植成活的能力。,(2)实体瘤分化诱导模型 人胃癌分化诱导模型 国内外有人用DMSO、HMBA、suramin、维甲酸、大蒜油及大蒜与其烯丙基硫化合物等处理胃癌细胞株时，癌细胞在形态结构、功能代谢和生物学等方面均出现分化特征。 人神经母细胞瘤分化诱导实验 在正丁酸、苯丁酸及其盐类作用后，瘤细胞可形成树突状结构，功能上能产生神经递质合成酶，生物学上其致瘤性明显降低，表现出分化的特点。,人粘液表皮样癌分化诱导实验 MEC-1细胞在HMBA的作用下出现分化表型：生长抑制、核异型性降低、表面微绒毛减少、胞浆内粗面内质网增加和出现特征性的成熟分泌颗粒、DNA含量减少及倍体趋向二倍体等。 其它实体瘤分化诱导模型 其它实体瘤如黑色素瘤、肝癌、前列腺癌、胶质母细胞瘤、肺癌等均有报道。,2.体内分化诱导模型 人白血病细胞一般采用小鼠腹腔扩散法及裸鼠皮下移植法; 人实体瘤采用小鼠肾包膜下移植和裸鼠移植建立分化诱导模型。 疗效评价：根据肿瘤生长抑制和荷瘤鼠生命延长，细胞标记酶、抗原以及形态的变化来判断。,四、诱导肿瘤细胞分化的调控机制,维甲酸包括多种同分异构体，其中最重要的是13-顺式维甲酸（13-cis-RA）、全反式维甲酸（ATRA）和9-顺式维甲酸（9-cis-BA）,机体内一定浓度的维甲酸可调节细胞的增殖、分化、成熟，是机体正常生长发育和各种生理活动必不可少的重要因子。RA对多种肿瘤细胞有诱导分化作用，尤其是对急性白血病具有较高的疗效。,维甲酸,活化的受体,维甲酸响应元件,结合,靶基因转录启动的调节,异常分化信号靶点,1.核内受体途径,RAR的结构,RAREs （维甲酸反应元件）,共抑制因子/HDAC 复合物,配体非依赖激活区,配体结合区,（二聚体形成部位）,RAR的功能,RAR和RXR形成二聚体，与靶基因启动子RARE结合激活转录。 双向调节转录功能： Unliganded RAR/negative Liganded RAR/stimulate,双向调节转录功能,配体缺乏时抑制转录 共抑制因子 N-CoR SMRT 组蛋白去乙酰化酶 配体存在时激活转录 生理浓度（10-8 mol/L) 维甲酸 共激活因子（CBP/P300，P/CAF，NcoA-1/SRC-1，P/CIP）具有强烈的组蛋白乙酰化酶活性,PML-RAR的结构和功能,PML-RAR：RBBC结构，RAR B至F功能域 机制： RXR扣押 PML-RAR与N-CoR/SMRT/Sin3A紧密结合（10-6 ATRA） PML-RAR/PML，PML-RAR/PML-RAR 竞争性阻断野生型RAR与RARE结合 以配体非依赖的方式激活或抑制粒细胞分化有关基因 POD结构解体，PML正常定位变化 阻止分化，抑制凋亡,APL细胞中染色体易位,维A酸受体断裂或重排,影响靶基因的转录表达,影响分化,维A酸受体功能一定程度恢复,治疗剂量 维A酸,靶基因转录表达,诱导APL细胞分化,治疗作用,2. 影响基因转录 Naka 等用9-cis-维甲酸诱导胃癌细胞株分化研究中，发现大多数胃癌细胞株能合成RARs和RXRs mRNA.,9-cis-维甲酸抑制细胞生长是通过调控细胞周期，影响维甲酸受体mRNA转录,3. 对癌基因和抑癌基因的影响 细胞的基因控制细胞的生长与分化，而这些基因的变化则影响基因的表达或功能被认为是癌变的主要原因。 Ras基因 在细胞内有H-，K-，N-Ras，编码分子量为21kd的蛋白，p21Ras蛋白具有GTP酶活性。 C-myc 过表达可以促进基因转录和细胞分裂，与肿瘤的形成关系密切。 P53 基因编码P53蛋白，P53蛋白有野生型和突变型，野生型P53基因具有抑制细胞增殖和转化的作用。,李晓光等用大蒜油诱导MGC803细胞分化和凋亡研究中，发现处理组细胞形态接近正常细胞，细胞的致瘤性明显下降，Northern杂交有P53和P21表达增强，提示大蒜油通过促进抑癌基因P53、P21的表达，抑制细胞恶性增殖、诱导凋亡和促进细胞分化。 大蒜油诱导人胃癌细胞分化和凋亡研究.中华肿瘤杂志1998；20(5)325327,王代树等用HMBA诱导MGC803细胞分化时发现C-myc和C-H-ras表达抑制。 这些基因在诱导癌细胞分化过程中的改变进一步影响其调控的基因表达而实现瘤细胞分化的效应。,4.影响细胞周期蛋白活性 细胞周期的失调控是癌症发生发展的原因，而细胞周期素cyclins、细胞周期素依赖性激酶CDKs及调节CDKs的激酶和磷酸酶则是细胞周期调控的分子基础。在真核生物细胞进行有丝分裂时，其细胞周期可分为间期（G1期、S期、G2期）和M期，G1期细胞可进入持续时间不等的G0期。,Lee 用Acteoside处理HL60细胞株时，发现可使该细胞生长停止和诱导分化，且分化的启动与cdk2、cdk6失活相一致, cyclinE和D1缺失.,CDK抑制剂p21CIP1/WAF1 和 p27KIP1蛋白和mRNA表达随时间逐渐增加,五、细胞分化临床应用,1960年Pierce首先发现小鼠睾丸畸胎瘤细胞可自发地分化成良性的正常细胞，证实了上世纪50年代提出的是否可通过诱导肿瘤细胞分化来治愈恶性肿瘤，开创了恶性肿瘤的分化诱导研究。 1971年Friend报导了小鼠红白血病细胞被二甲基亚砜(DMSO)诱导分化，在DMSO作用下，血红蛋白合成增多证实了体外诱导分化的可能。,1980-1983年世界各国学者应用维甲酸和异构体维甲酸作用于HL-60和U937细胞株细胞，有诱导分化作用。 1986年中国上海王振义教授应用全反式维甲酸(ATRA)治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)获得了72%的完全缓解，开创了临床应用诱导分化剂治疗白血病的先河。,从1960-2007年全球已发现和合成诱导分化剂大约有80种，现已应用于临床有效的诱导分化剂大约有30种 。,(一) 全反式维甲酸( ATRA）,1、ATRA治疗APL的基本原则 （1）诱导治疗 ATRA 45mg/m2 DNR 50mg/m2 D1-4 Ara-c 200mg/m2 D1-7 ATRA 45mg/m2+DNR60mg/m2 D1-3 Ara-c 200mg/m2 D1-7 ATRA 45mg/m2 IDA 12mg/m2 D2，4，6，8 新药临床试验,（2）巩固治疗： As2O3 0.15mg/kg/d D1-5,连续5周,共2周期 后续 ATRA 45mg/m2 D1-7 + DNR 50mg/m2 D1-3,共2周期 DNR 60mg/m2 D1-3 + Ara-c 200mg/m2 D1-7，共1周期 后续 Ara-c 1.5-2g/m2/q12h，D1-5，+ DNR45mg/m2 D1-3 ， 共1周期+IT 共5次 ATRA 45mg/m2 D1-15，+Ara-c 200mg/m2 D1-4，共1周期， 后续 ATRA 15天，+MIT 10mg/m2/d，共5天，共1周期， 后续 ATRA 15天，+IDA 12mg/m2/d，共1周期， +Ara-c 150mg/m2/8h D1-4，共1周期,（3）维持治疗： PCR 基因(-) ATRA+/-，6-MP+MTX维持治疗1-2年 每3月行分子生物学检测基因 PCR 基因(+) 4周内复查基因，若阴性开始维持治疗，否则继续复发方案治疗。 参考方案 1）意大利：每3个月服用15天ATRA。 2）法国：每月服用5天ATRA。,2、维甲酸综合症 1，发热，呼吸窘迫，心包与胸腔积液， 低血压和肾功能衰竭。 2，发生率：23-50% 3，死亡率：30%以上 4，治疗方法：1）立即停药 2）地塞米松 10mg iv，bid。 应用5天以上。,3、ATRA的副作用,1、高颅压综合症：1）停药 2）对症治疗 2、高组织胺综合症：1）停药 2）组织胺拮抗剂,4、砷剂及ATRA协同作用(体外),As2O3 ATRA APLCR (靶组织PMLRAR机制不一) As2O3 ATRA 单一治疗仅使PML-RAR等基因鼠延长生存2-3倍 As2O3 ATRA 合用, 经9mDFS, 使肿瘤清除,急性早幼粒白血病治疗研究（一）,1，在美国进行的有关APL治疗研究中，患者随机接受全反式维A酸(ATRA)或常规阿糖胞苷-柔红霉素初始治疗。 2，之后，所有患者都给予2个疗程的巩固化疗。 3，随后再次随机分组：一组单用ATRA维持治疗，另一组行临床观察。,结果,1,结果全反式维A酸(ATRA)或常规阿糖胞苷-柔红霉素化疗两组疗效类似，完全缓解率均在70%左右，诱导治疗中死亡率均为12%14%。 2,但是，无论将ATRA用于诱导治疗还是维持治疗，无病生存率都高于相应的对照组。 3,接受ATRA治疗 (无论何时使用) 的患者，70%在随后2年半中未见复发，而从未接受过ATRA治疗的患者2年半中80复发；在诱导治疗和维持治疗中都使用ATRA的患者，预后最好。,2019/9/3,41,可编辑,全反式维A酸(ATRA)和常规阿糖胞苷-柔红霉素化疗两组无病生存率比较,缓解后接受ATRA治疗和临床 观察的两组无病生存率比较,1,常规化疗+维甲酸 2,常规化疗+临床观察 3,维甲酸 +维甲酸 4,维甲酸+临床观察 无病生存率比较,急性早幼粒白血病治疗研究（二）,另一项在法国进行的有关APL治疗的研究，比较了ATRA治疗后再行化疗和ATRA治疗并于第3天开始化疗的果。 ATRA治疗 化疗 ATRA治疗 + 化疗,结果一,1,结果提示，两者完全缓解率都为92%； 2,但是ATRA治疗同时行化疗者，2年复发率仅为6%，而ATRA治疗后再行化疗者，2年复发率达16%。,4年复发率,4年无病生存率,4年总生存率,3年复发率-A组,3年复发率-B组,3年复发率-C组,OS,EPS,RFS,OS,(二) 丹参提取物丹参酮,丹参酮是中药丹参的乙醚提取物，主要成分为丹参酮-A(Tan-A)，体外实验证明对APL细胞具有良好的诱导分化、抑制增殖作用。 作用机制：抑制肿瘤基因c-myc和bcl-2表达、增强P53和c-fos表达有关。,（三）丁酸及其衍生物,丁酸(BA)在体外可介导多种肿瘤细胞分化，可抑制组蛋白去乙酰化酶(HDAC) ，促进基因转录表达，促进细胞分化。 BA的副反应小，但血浆浓度低，不易达到治疗浓度。而其衍生物，三丁酸苷脂(TB)可在体内代谢为BA，提供所需浓度，达到治疗目的。,（四） 维生素K类化合物,除了作为止血剂外，还可氧化耗竭细胞内还原型GSH，促进氧自由基产生及巯基蛋白的芳香化，达到抑制肿瘤细胞增殖，诱导凋亡的目的。同时，可加强其他药物的效应，作为治疗APL的一种辅助用药。,（五） AS2O3,AS2O3也有诱导分化的作用，主要是通过丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路减少甲状腺素沉默介导因子(SMRT)的磷酸化，快速抑制SMRT共抑制物与PML/RAR融合蛋白之间的相互作用，从而诱导细胞分化。 AS2O3也有促进小泛素相关修饰物(SUMO)与PML/RAR融合蛋白的结合作用，增加早幼粒白血病核小体(PMLNBs)的降解而诱导细胞分化。,六、维生素D及衍生物,维生素D及衍生物最早在上世纪七十年代应用于临床，但由于受到疗效限制未见大的进展(表6)。 表6 维生素D及衍生物的临床应用 治疗疾病 疗效 VD3 乳癌、直结肠癌 个体疗效 EB1089 直结肠癌 延长OS MC903 乳腺癌 延长转移 VD3 淋巴瘤 有效率24% VD3 MDS、骨纤 少数有效,七、表现遗传学(epigenetics)在肿瘤诱导分化治疗中的作用,组蛋白修饰 乙酰化(HATs) 去乙酰化（HDACs） DNA甲基化 甲基转移酶（(DNMT1, DNMT3a, DNMT3b),HDAC与共抑制蛋白,NURD Sin3 NCoR SMRT,形成共抑制复合物,HDAC i的抗肿瘤效应,抑制生长 诱导凋亡 诱导分化,1970年代首次发现HDACi可诱导急性红细胞白血病细胞分化 1990首个HDACi Hexamethylene bisacetamide诱导 血液肿瘤患者缓解 Blood 80 (1992) 26042609.,11种HDAC,HDACI HDACII HDACIII 与miRNAs、DNMT1有交叉，作用底物不仅仅限于组蛋 白,HDACi的诱导分化作用,PLZFRAR, APL 中占 5%, RA治疗无效 HDACi+RA 两者联合可诱导分化 HDACi 增加RA疗效,1、AML,2、淋巴瘤 BCL-6 高表达于生发中心来源的B细胞， 一种转录因子抑制因子 HDAC I 和HDAC II 上调BCL-6表达 HDACi 诱导B细胞淋巴瘤细胞周期阻滞和凋亡,3、实体瘤 神经母细胞瘤 N-myc 结肠癌 前列腺癌 乳腺癌 小