pcr技术发展概述.ppt

临床实验室中,PCR技术及其应用,江苏大学 周滔,提纲,病毒性心肌炎的临床实例分析 柯萨奇病毒的实验室检测方法 引申,PCR技术,以及DNA测序,六月,18区30床女病人,主诉:上感(鼻塞,轻微咳嗽,无痰,无咽痛),乏力(需扶墙走, 不能拿东西),头晕.体温38.5C 体征:胸痛(瞬间痛)无胸闷,发痛前有牙龈肿痛两周,未见脓,未闻及心包摩擦音,奔马律.BP:92/62mmHg,P:92/min.,六月30日入院时:2,3,aVF导联抬高0.2mV. CK 503U/L,CK-MB 56U/L.(当时未查Tro) 7月2日:K 3.1(3.5-5.5)mmol/L,Tro 5.27 (0-0.1)mmol/L,CK-MB 79.44(0.00-16.00)mmol/L,CK 1123.0(20-200)U/L,hs-CRP 11.53(0.0-3.00)mg/L.,ECG:,aVF导联提示下壁ST段抬高;V4,5,6提示心尖导联抬高. 好转以后T波倒置,异常Q波,有演变表现 心超:收缩功能下降,室壁活动下降,无间断性,普遍的活动降低.,病毒性心肌炎? 急性心肌梗死?,初步诊断,甲强龙腎上腺皮质激素,下调免疫反应.(渐停) 罗氏芬,抗感染. 多巴胺,强心升血压 VitC ,VitB6,二磷酸果糖,营养心肌 Kcl,Mgcl2,采取措施,实验室后继推荐检查,病毒抗体效价滴定:Ab效价640?(320为可疑) ELISA 查柯萨奇病毒IgM,IgG.,PCR作为临床科研常用的基因诊断方法,其扩增片段的特异性主要由引物决定,所以设计引物成为PCR成功的关键. 在此,以柯萨奇病毒B3(CVB3)为例,柯萨奇病毒 B组3型,GenBank:AY752944.2 球形,衣壳20面体,核心为单正RNA病毒,有衣壳蛋白(VP),编码VP1,tgtcaggctattgaaggacactcctttcatttcgcaggaaaactttttccagggcccagtggaagacgcgataacagccgctatagggagagttgcggat TaqII | taccagataaagttgattcatacgtgtggcaaacatctacgaatcccagtgtgttttggaccgagggaaacgccccgccgcgcatgtccataccgttttt 3000 atggtctatttcaactaagtatgcacaccgtttgtagatgcttagggtcacacaaaacctggctccctttgcggggcggcgcgtacaggtatggcaaaaa 2910 2920 2930 2940 2950 2960 2970 2980 2990 AhdI PfoI | | gagcattggcaacgcctattcaaatttctatgacggatggtctgaattttccaggaacggagtttacggcatcaacacgctaaacaacatgggcacgcta 3100 ctcgtaaccgttgcggataagtttaaagatactgcctaccagacttaaaaggtccttgcctcaaatgccgtagttgtgcgatttgttgtacccgtgcgat 3010 3020 3030 3040 3050 3060 3070 3080 3090 tatgcaagacatgtcaacgctggaagcacgggtccaataaaaagcaccattagaatctacttcaaaccgaagcatgtcaaagcgtggatacctagaccac 3200 atacgttctgtacagttgcgaccttcgtgcccaggttatttttcgtggtaatcttagatgaagtttggcttcgtacagtttcgcacctatggatctggtg 3110 3120 3130 3140 3150 3160 3170 3180 3190 ctagactctgccaatacgagaaggcaaagaacgtgaacttccaacccagcggagttaccactactaggcaaagcatcactacaatgacaaatacgggcgc 3300 gatctgagacggttatgctcttccgtttcttgcacttgaaggttgggtcgcctcaatggtgatgatccgtttcgtagtgatgttactgtttatgcccgcg 3210 3220 3230 3240 3250 3260 3270 3280 3290 atttggacaacaatcaggggcagcgtatgtggggaactacagggtagtaaatagacatctagctaccagtgctgactggcaaaactgtgtgtgggaaagt 3400 taaacctgttgttagtccccgtcgcatacaccccttgatgtcccatcatttatctgtagatcgatggtcacgactgaccgttttgacacacaccctttca 3310 3320 3330 3340 3350 3360 3370 3380 3390,.aaactttttccagggcccagtggaagacgcgataacagccgctataggga. .K L F P G P S G R R D N S R Y R E N F F Q G P V E D A I T A A I G R T F S R A Q W K T R * Q P L * G .tttgaaaaaggtcccgggtcaccttctgcgctattgtcggcgatatccct.,5-,.ggtagtaaatagacatctagctaccagtgctgactggcaaaactgtgtgtggga. .G S K * T S S Y Q C * L A K L C V G V V N R H L A T S A D W Q N C V W E * * I D I * L P V L T G K T V C G K .ccatcatttatctgtagatcgatggtcacgactgaccgttttgacacacaccct.,3-,5-,3-,CVB3 VP1基因序列,G+C=13,A+T=7 Tm=(52+14)-5=61,G+C=12,A+T=8 Tm=(48+16)-5=59,keynote,一般引物长度为1830碱基 GC含量,在4060%左右 退火温度 引物自身不应有发卡结构,决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度,在引物长度小于20bp时：4(G+C)+2(A+T)-5 在引物长度大于20bp时：62.3+0.41(%G-C)-500/length-5,引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小,引物3端是延伸开始的地方,所以不可以有连续的gggccc的序列,keynote,扩增基因片段要大于1个ORF,常选择150bp以上,Forward Primer length:20bp GC含量13/20=65% Tm initial/Tm final : 34. / 64.6,Reverse Primer length:20bp GC含量:12/20=60% Tm initial/Tm final : 34./ 60.5,总结,PCR扩增目的基因片段,关键在于一对引物的设计,而引物的设计要同时满足多个条件,尤其是当目的片段基因GC/AT含量明显有倾向时,就要在倾向一侧加A,T或者GC,来达到合适的GC含量,但是又不能有发卡结构,又要保证特异性 扩增的片段要进行检测,可以跑条带,和marker做比对,但是往往后续实验常用限制性内切酶继续修饰两端,达到和其他基因或者质粒连接的目的,非编码区的数量与生物进化程度有密切关系，在微生物中，非编码区只占整个基因组序列的10%20；但在高等生物和人类基因组中，非编码序列则占了基因组序列的绝大部分。 在非编码区还存在大量的重复DNA序列，这些DNA看似没有意义也不能编码蛋白质，却能形成特殊的DNA高级结构，并以此调节附近基因的活性。,对非编码区的一个主要研究方向是对调控元件的研究。因为在非编码区，只有一小部分已被证实为有用成分，能帮助基因开启和关闭以调控基因的表达，即调控DNA,也称为启动子。,序列捕获芯片技术,用微乳滴PCR(emulsion PCR, emPCR)来生成扩增产物. 将固化引物的微球与单链DNA文库模板以及必要的PCR反应化合物一起混合, 微球与文库片段的比例适当, 以确保大多数微球结合的单链DNA分子不超过一个. 水溶液与油混合形成油包水结构乳滴. 每个乳滴都是一个进行后续PCR反应的微型化学反应器. 经过多轮热循环, 每个微球表面都结合了数千个相同的DNA拷贝. 然后打破微乳滴后, 扩增微球被收集、富集并固定在一个平的玻璃基板上形成一个无规则的阵列. 转移并放置到刻有规则微孔阵列的微孔板上. 每个微孔只能容纳一个微球. 微孔板被安装成为流通池的一部分. 其中一面可以通过测序反应的化合物, 另一