基因在大肠杆菌和酵母的高效表达.ppt

本章目录,4.1 基因的表达系统与表达策略 4.1.1 基因的表达系统 4.1.2 根据表达蛋白用途选择基因的表达策略 4.2 基因在大肠杆菌中的高效表达 4.2.1 基于T7噬菌体RNA聚合酶/启动子的大肠杆菌表达系统 4.2.2 蛋白质的融合表达 4.2.3 蛋白质的分泌型表达 4.2.4 蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复性 4.3 基因在酵母中的高效表达 4.3.1 酵母表达系统概述 4.3.2 甲醇酵母表达系统 4.3.3 组织纤溶酶原激活剂在甲醇酵母中的表达,第一节 基因的表达系统与表达策略,基因的表达系统 基因的高效表达策略,一、基因的表达系统,表达载体的组成： DNA复制及质粒DNA的筛选: 有DNA复制起点ori, 及Amp, Tet抗性基因 目的基因转录的调控系统:这一系统包括启动子,抑制物基因和转录终止子.启动子位于目的基因的上游,常用的如Placz等. 蛋白质的翻译系统:包括核糖体识别位点SD,翻译起始密码子和终止密码子.,表达系统的种类,原核表达系统 真核表达系统 酵母 植物拟南芥 昆虫 哺乳动物细胞系,一） 原核表达系统：细菌,大肠杆菌表达外源基因的优势,繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 基因克隆及表达系统成熟完善 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物,大肠杆菌表达外源基因的劣势,缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白 细胞周质内含有种类繁多的内毒素,二）真核表达系统,全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的,酵母表达系统,哺乳动物细胞系,可以悬浮培养, 生长快, 连续传代 精确的糖基化 胞外表达 人本身的细胞系，人的表达系统,二、基因的高效表达策略,用于生物化学和分子生物学研究： 重点考虑如何保持蛋白质原有的功能 表达蛋白用作抗原：合成天然蛋白及表达融合蛋白的策略,考虑如何便于分离 用于蛋白质结构研究：形成可溶性蛋白质，保持结构完整,第二节 基因在大肠杆菌中的高效表达,大肠杆菌高效表达设计 基于T7噬菌体RNA聚合酶/启动子的大肠杆菌表达系统 蛋白质的融合表达 蛋白质的分泌型表达 蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复性,一、外源基因在大肠杆菌中高效表达的设计,启动子,终止子,核糖体结合位点,密码子,质粒拷贝数,1.启动子,启动子的构建,-35 区序列,-10 区序列,PlL,PrecA,Ptrp,Plac,PtraA,Ptac,启动子,T T G A C A,G A T A C T,T T G A T A,T A T A A T,T T G A C A,T T A A C T,T A G A C A,T A A T G T,T T T A C A,T A T A A T,T T G A C A,T A T A A T,Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac,启动子,启动子的可控性,P,乳糖启动子Plac的可控性：,O,P,O,高效转录,阻遏蛋白,诱导,乳糖 异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）,基底水平转录,启动子,启动子的可控性,Plac,乳糖启动子Plac的可控性：,O,Plac,O,高效转录,葡萄糖代谢,基底水平转录,基因工程中使用的乳糖启动,子均为抗葡萄糖代谢阻遏的,突变型，即Plac UV5,CAP,cAMP,cAMP浓度降低,Plac UV5,O,高效转录,2. 核糖体结合位点,大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构： 位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列：5 UAAGGAGG 3，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它与大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3端区域3 AUUCCUCC 5并与之专一性结合； 翻译起始密码子AUG； SD序列与翻译起始密码子之间的距离(7bp)及碱基组成； 基因编码区5 端若干密码子的碱基序列,二、 基于T7噬菌体RNA聚合酶/启动子的大肠杆菌表达系统,优点： 1）T7噬菌体RNA聚合酶合成RNA的速度高于大肠杆菌5倍； 2）T7噬菌体RNA聚合酶只识别自己的启动子序列，不启动大肠杆菌DNA任何序列的转录； 3）T7噬菌体RNA聚合酶对抑制大肠杆菌RNA聚合酶的抗生素有抗性； 4）T7噬菌体RNA聚合酶/启动子系统在一定条件下，基因表达产物可占细胞总蛋白的25以上。,载体与受体系统,载体：pET表达系统（pET15，pET16，pET28，pET30，pET42等a/b/c三套，及pRSET） 大肠杆菌菌株：BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS。(DE3)菌株基因组上以溶原形式携带一个克隆的T7RNA聚合酶基因，IPTG（异丙基硫代D半乳糖苷）可诱导T7RNA聚合酶大量合成。,T7启动子,pET28a 结构,MCS,lacZ,三、 蛋白质的融合表达,蛋白质融合表达是指外源基因与载体已有的担体蛋白的编码基因拼接在一起，并作为一个新的开放阅读框进行表达。 在这种融合蛋白结构中，通常载体的担体蛋白部分位于N端，目的蛋白位于C端。 通过人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收目的蛋白。,谷胱甘肽S转移酶（GST）融合蛋白表达系统 pGEX载体,酶促裂解法：多残基位点,启动子,担体基因,接头,目的基因,Met,Arg,Stop,Ile-Glu-gly-Arg 凝血因子Xa的识别、作用序列,Ile-Glu-gly-Arg,表达,亲和层析,酶解回收,用于融合蛋白构建的担体蛋白：,融合型目的蛋白表达系统的构建,谷胱甘肽转移酶（GST） 维持良好空间构象 金黄色葡萄球菌蛋白A（SAPA） 免疫亲和层析 pRIT2T 硫氧化还原蛋白（TrxA） 维持良好空间构象 pTrxFus b-半乳糖苷酶（LacZ） 免疫亲和层析 泛素蛋白（Ubi） 维持良好空间构象,以融合形式表达目的蛋白的优缺点,目的蛋白稳定性高 目的蛋白易于分离 目的蛋白表达率高 目的蛋白溶解性好 目的蛋白需要回收,目的蛋白的回收,化学断裂法：如溴化氰（CNBr）它与多肽链中的甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反应，生成溴化亚氨内酯，后者不稳定，在水的作用下肽键断裂，形成两个多肽降解片段。 酶促裂解法,酶促裂解法：单残基位点,蛋白内切酶,切割位点,梭菌蛋白酶 Arg-C,葡萄球菌蛋白酶 Glu-C,假单孢菌蛋白酶 Lys-C,猪胰蛋白酶 Arg-C,Lys-C,Arg C,N,N,C,担体蛋白,目的蛋白,每种蛋白酶均具有相应的断裂位点决定簇 单残基位点断裂的蛋白酶 如在精氨酸、谷氨酸、赖氨酸 残基处切开酰胺键，使目的蛋白分离,酶促裂解法：多残基位点,启动子,担体基因,接头,目的基因,Met,Arg,Stop,Ile-Glu-gly-Arg 凝血因子Xa的识别、作用序列,Ile-Glu-gly-Arg,表达,亲和层析,酶解回收,四、 蛋白质的分泌型表达,是指周质蛋白、细胞内膜与外膜蛋白等以带有N端信号肽的前体形式首先在细胞质中合成，随后穿膜运送到周质或定位到内、外膜上的分泌过程。穿膜过程中，信号肽被信号肽酶切除。将目的蛋白的基因置于原核蛋白信号肽的序列的下游可能实现分泌型表达。,分泌表达的优点：,信号肽被切除后的蛋白质N末端的氨基酸序列与天然蛋白是一致的 周质空间中的蛋白酶活性比细胞质中的要低，从而使蛋白质较稳定地存在于周质中 周质中只有少量的细菌蛋白，使分离纯化更容易 周质空间存在一个氧化的环境，使得二硫键更容易形成,五 蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复性,在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。 蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。 由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。,能简化外源基因表达产物的分离操作,包涵体表达形式的优点：,能在一定程度上保持表达产物的结构稳定,包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来,在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁,包涵体表达形式的缺点：,以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象的目标蛋白。,以包涵体形式表达目的蛋白的操作,如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量20%以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是选择高表达的载体。,包涵体的变性与复性操作,（1）包涵体的溶解与变性,拆开错配的二硫键和次级键 能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括： 清洗剂：SDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化 促溶剂：盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应 混合溶剂：如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强 极端pH：廉价，但许多蛋白质在极端pH条件下发生修饰反应,包涵体的变性与复性操作,（2）包涵体的复性与重折叠（refolding）：,包涵体的复性与重折叠的主要任务是： 将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠 通过次级键的形成使蛋白质复性,包涵体的变性与复性操作,包涵体的复性,分段稀释法，逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生 试剂添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+ 蛋白修饰法，氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚 分子伴侣法，GroEL、GroES、DnaK，固定化，共表达,包涵体的变性与复性操作,包涵体的重折叠（refolding）：二硫键形成,+,2e,+,2H+,A,S-S-R,HS,+,B,R-S-S-R,2R-SH,化学氧化法（A）需要电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形成随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠 二硫键交换（B）需要还原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和GSSG），二硫键形成相对特异，因此适用性较广，重折叠效果好,六、 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素,胰岛素的结构及其生物合成,人胰岛素的生产方法,重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建,胰岛素的结构及其生物合成,S,S,S,S,C,N,S,S,B 肽（30）,C 肽（31）,A 肽（21）,R,R,R,K,S,S,S,S,C,N,S,S,N,C,高尔基体内的特异性肽酶,N,C,信号肽,B 肽,C 肽,A 肽,信号肽酶,基因工程法制人胰岛素,1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。 由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有无免疫原性、注射吸收迅速等优点，充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力。,重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建,A链和B链分别表达法,tac,tac,b-Gal,b-Gal,A peptide,B peptide,ori,ori,Apr,Apr,Met,Met,Met,Met,M,M,N,C,M,M,N,C,化学合成A链,和B链的编码,序列,重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建,A链和B链分别表达法,M,M,N,C,M,M,N,C,b-Gal,b-Gal,A,B,CNBr 处理,N,C,N,C,N,C,N,C,Cys 体外氧化和重折叠,分离纯化,重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建,由于A链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低，通常只有10% - 20%，因此采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以上。 为了进一步降低生产成本，美国Ely LiLi公司随后又建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线。,A链和B链分别表达法,重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建,人胰岛素原表达法,tac,b-Gal,C peptide,ori,Apr,Met,Met,M,M,N,C,B peptide,A peptide,人胰岛素原的cDNA,重组人胰岛素原,转化,分离纯化,重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建,人胰岛素原表达法,S,S,S,S,C,N,胰蛋白酶,C peptide,A peptide,B peptide,M,R,R,K,R,CNBr,R,S,S,S,S,C,N,N,C,R,羧肽酶B,B链中第22位上的Arg和第29,位上的Lys由于良好折叠的原,因，对胰蛋白酶不敏感,重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建,人胰岛素原表达法,在人胰岛素原表达工艺中，由于C肽的存在，胰岛素原能形成良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折叠率高达80%以上。虽然这条工艺路线并不比AB链分别表达法更为简捷，而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成本仅50美元。 目前美国Ely LiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。,第三节 基因在酵母中的高效表达,酵母表达系统概述 甲醇酵母表达系统 组织纤溶酶原激活剂在甲醇酵母中的表达,一 酵母表达系统概述,优点：克服大肠杆菌表达系统的不足，可以进行蛋白质翻译后的修饰合加工。 缺点：缺乏强有力的启动子，分泌效率差，表达菌株不够稳定，表达质粒易于丢失等。,酵母宿主菌,酿酒酵母系统：,酵母属 如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）,甲