creloxp基因敲除系统.ppt

基因敲除 Knock Out,背景介绍,1981 年Evans 等首次在体外分离和培养ES，成功建立了小鼠胚胎干细胞系,1985 年Smithies最早在哺乳动物细胞中发现并实现了同源重组,同源重组 Homologus Recombination,同源重组是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组,同源重组示意图,同源重组示意图,一、Cre/Loxp系统,Cre重组酶（37） 位点特异性重组酶，介导loxp 位点间的序列同源重组 70%重组率，无需辅助因子，多种 结构的DNA底物 Loxp site 34bp反向重复序列 Flp/Frt重组系统,P1噬菌体,（1）重组方式,（2）基因敲除机理,Offspring：50% heterozygous knockout after 1 generation,基因敲除机理 （续）,Offspring: 25% homozygous knockout after 2 generation,二、基因敲除的基本流程,（1）打靶载体构建,Conditional Knockout,Exon1,3N,GT/AG,Attention:,（2）转化ES细胞,电穿孔或是显微注射方法将构建好的打靶载体导入ES细胞,电转需要的细胞数量2-5x107,（3）阳性克隆筛选,随机整合 定点整合 没有整合,DTA(白喉毒素A亚基）,（4）囊胚注射,小鼠的遗传背景取决于ES和囊胚细胞,（5）嵌合体小鼠,（6）品系纯化,Loxp2小鼠品系建立完成,纯合突变小鼠用来和Cre小鼠杂交，杂合突变小鼠保种,三、Cre工具鼠的构建,DNA显微原核注射，是指将外源DNA通过显微注射的方法注射到受精卵的原核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的基因组中，并稳定遗传给后代。,诱导性组织特异性Cre工具鼠的载体构建,D.S. Sohal, M. Nghiem. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circ Res. 89:20-25 (2001).,MHC (cardiac-specific a-myosin heavy chain) Mer (mutated murine estrogen receptor ligand-binding domain amino acids 281 to 599, G525R),MerCreMer融合蛋白,该系统将雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)的配体结合区(ligand-binding domain,LBD)和Cre重组酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌合重组酶的表达被置于特异启动子的调节之下，从而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组酶的活性，因为雌激素受体结合区的存在使其不能进入核内与lo