血液分析仪.ppt

,第三章 血液分析仪,自动血液分析仪（automated hematology analyzer, AHA)，早年称血细胞计数仪（blood cell counter)是目前国内外临床检验最常用的筛检仪器之一。,血细胞分析仪的类型,对白细胞分析程度 二分群 三分群 五分类 自动化程度： 半自动仪器须手工稀释标本 全自动仪器可直接用抗凝血进样,第一节 检测原理及技术 第二节 检测参数和临床应用 第三节 校准、性能评价和质量保证,主 要 内 容,第一节 检测原理及技术,检测原理,电学,光学,电阻抗法,激光散射法,射频电导法,分光光度法,一、电学检测原理及技术,(1) 电阻抗原理(库尔特原理 Coulter),库尔特原理 利用电阻抗法测量细胞的数量和体积。 血细胞是电的不良导体，当一个细胞通过计数小孔时，会导致小孔两端电阻的变化，将其转化成脉冲，感应器通过检测脉冲的数量及大小，从而计算出通过小孔的细胞数量及体积。,细胞体积越大，脉冲振幅越高；细胞数量越多，脉冲数量也越多。,（2）射频电导法,射频（radio frequency, RF) 指射频电流，是每秒变化大于10 000次的高频交流电磁波。高频电流能通过细胞膜。 用高频电磁探针渗入细胞膜脂质可测定细胞的导电性，提供细胞内部化学成分、细胞核和细胞质、颗粒成分等特征信息。,二、光(化)学检测原理及技术,（1）激光散射法 应用了流式细胞术(flow cytometry, FCM) 检测原理。 流式细胞术检测原理：细胞通过激光束被照射时，产生与细胞特征相应的各种角度的散射光。对经信号检测器接收的散射光信息进行综合分析，即可准确区分正常类型的细胞。,鞘流技术:在流动液体的作用下，细胞在检测小孔的中央成单列通过。,半导体激光流式细胞术,低角度散射光（前向散射光）：反映细胞的数量和表面体积大小。 高角度散射光（侧向散射光）：反映细胞的内部颗粒、细胞核等复杂性。 激光散射法在区别体积相同而类型不同的细胞特征时， 比电阻抗法分群更加准确。故激光散射法已成为现代五分类血液分析仪的主要检测原理之一。,（2）分光光度法,分析仪检测Hb 的原理： 被稀释的血液加入溶血剂后，红细胞溶解，释放血红蛋白，后者与溶血剂结合形成Hb衍生物，在特定波长（530550nm）下比色，吸光度的变化与液体中Hb含量成比例。,血红蛋白,血红蛋白 衍生物,吸光度,Hb浓度,540nm,溶血剂,白细胞五分类计数及相关参数检测 （1）激光与细胞化学法 （2）容量、电导、光散射法(VCS技术) （3）电阻抗与射频法 （4）多角度偏振光法,三、组合应用电学、光（化）学检测技术,第二节 检测参数和临床应用,检测参数 结果显示和临床应用 结果复检,一、检测参数 （一）可报告参数 是指经国家认可或美国FDA批准可用于临床报告的血液分析仪参数。 （二）研发参数 随着检验原理、技术发展和临床应用证据的建立，研究中参数有可能转为临床应用参数。,二、结果显示和临床应用 （一）结果显示 1相关参数的数据显示 2图形显示 （1）直方图 横坐标为血细胞体积大小 纵坐标为不同体积细胞的相对频率。 （2）散点图,（二）临床应用 （1）红细胞参数 1）红细胞体积分布宽度（RDW） 2）红细胞血红蛋白分布宽度（HDW） 3）有核红细胞（NRBC） 4）球形红细胞平均体积（MSCV）和网织红细胞平均体积（MRV） 5）红细胞碎片（FRBCS）,（2）网织红细胞参数 1）未成熟网织红细胞比率（IRF） 2）网织红细胞成熟指数（RMI） 3）网织红细胞血红蛋白含量（RET-HE） 4）网织红细胞平均血红蛋白量（CHr）,（3）白细胞参数 1) 幼稚粒细胞百分比和计数（IG%/#） 2)造血祖细胞 ( HPC#) （4）血小板参数 1)血小板平均体积（MPV） 2)未成熟血小板比率(IPF),白细胞参数检测原理及应用,（一）电阻抗法,仪器将体积为35450fL的血细胞，分为256个通道（channel）。每个通道：1.64fl。根据细胞大小，分别置于不同的通道中，显示血细胞体积分布直方图(Histogram)。,根据电阻抗的原理，不同体积白细胞(35-450)fL产生脉冲大小的明显差异而区分相应的三群细胞：,3590f1,160fl以上,90160f1,经溶血素处理脱水后，血细胞体积大小发生了变化！ 白细胞通透性改变，胞质渗出胞膜紧紧裹在核或存在颗粒周围 第一群（3590fl）小细胞区：淋巴细胞（体积最小）。 第二群（90160fl）单个核细胞区，（中间细胞）：单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、原始、幼稚细胞、异常细胞等。 第三群（160fl以上）大细胞区：嗜中性粒细胞（体积最大）。,1. 分 群,2.正常白细胞分布直方图,三分群血液分析仪 正常白细胞分类模式图（直方图）,%,3.白细胞直方图的临床应用,白细胞直方图的变化，可评价血液中白细胞群体的变化，但这种变化的细胞图并无特异性，某一类白细胞的增多或减低均可使直方图产生相似的变化。 因此，异常白细胞直方图只能提示白细胞分群之间比例变化或可能出现异常细胞，故要求用显微镜复查血涂片。,异常白细胞直方图,急 白 一 个 高 大 细 胞 峰,白细胞直方图,（二）光散射法白细胞分类,激光与细胞化学法 容量、电导、光散射（VCS）法 电阻抗与射频法 多角度偏振光散射法,体积、电导和光散射法（volume, conductivity, light scatter, VCS),V C S,电阻抗技术,细胞大小和内部结构,细胞内的颗粒性、核分叶性和细胞表面结构,VCS法原理,1 应用电阻抗原理测量细胞体积(Volume，V)技术。 2 应用电导性（Conductivity C）技术。 检测的原理是：根据细胞壁能产生高频电流的性能，采用高频电磁探针，测量细胞内部结构，即以细胞核和细胞质的比例、细胞内颗粒的大小和密度，来辨别体积相同、但性质不同的两个细胞群体，如淋巴细胞和嗜碱性粒细胞。,VCS法原理,3 应用光散射(Light scatter，S)技术。 原理是：来自激光源的单色光直接扫描进入计数敏感区的每一个细胞，根据细胞产生不同角度的散射光(10一90)，可提供细胞形态、核结构等光散射信息，并能鉴别细胞颗粒的构型和质量，光散射可区别粒细胞(中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞)的类型。,体积 电导 光散射,2.多角度偏振光散射法（MAPSS),（1）白细胞计数 用含DNA染料碘化丙啶试剂可破坏有核红细胞膜和细胞质，只留下细胞核，裸核易于染色。染料对有活性的白细胞只有极小渗透性或无渗透性，故不出现细胞核染色。从而鉴别有核红细胞和活性白细胞，计算活性白细胞比率。,（2）白细胞分群,MAPSS,0,前向散射光：细胞大小、数量,7，侧向散射光：细胞内部结构及核染色质的复杂性,90，垂直角度散射光：细胞内部颗粒及分叶状况,90D，垂直角度去偏振散射光，鉴别E 与N,红细胞系列参数检测原理及应用,（一）电阻抗法,电阻抗法检测红细胞要注意白细胞增高干扰： 1 稀释血液中含有白细胞，当血液进入红细胞检测通道时，红细胞检测的各项参数中均含有白细胞因素。正常时，血液红细胞与白细胞的比例约为500：1750：l，因此，白细胞因素可忽略不计。 2 当病理情况下，如白血病时，白细胞数明显增高，同时又伴有贫血时，使所得红细胞参数可产生明显误差。,红细胞体积分布直方图,在36-360fl范围内分析红细胞，正常红细胞主要分布在50-200fl。 正常直方图上可见两个细胞群体： 50-125fl区域有一个几乎两侧对称、较狭窄的正态分布曲线； 主峰右侧约在125-200fl区域的细胞，为大红细胞和网织红细胞。,（二）流式细胞术光散射法,1、光散射法红细胞、血红蛋白检测原理 低角度(23)：测量红细胞体积。 高角度(515)：测定红细胞血红蛋白浓度。,2、红细胞散点图 是红细胞体积与血红蛋白浓度二维散点图，反映光散射与细胞体积和血红蛋白浓度之间的相互关系，能准确区分小红细胞等异常。线性体积/血红蛋白浓度（V/HC)散点图分为9个区。,血红蛋白的测定,（三）分光光度法,红细胞直方图,血小板参数检测原理及应用,根据电阻抗法，血小板随红细胞在一个系统中进行检测，在红细胞血小板计数池中计数2fl30fl的颗粒。,10 20 30(fl),正常血小板直方图,正常血小板直方图呈左偏态分布：230fl分布，主要在215fl。,异常血小板直方图,峰右移,左右侧起点较高,异常血小板直方图,右侧呈脱尾状,峰左移,三、结果复检,血涂片复检目的：是在保证患者不会因错误报告或可导致误诊的结果(假阴性结果)而承受风险的前提下，最大限度地减少不必要的复检(假阳性)的样品数量。,在Berend Houwen博士的倡导下，一组国际血液学专家交换了意见并组织使用多个不同生产厂家的仪器进行了一次大规模的研究，以确认统一的全自动血液分析仪检测结果复检标准，并据此提出41条复检规则。,第三节 校准、性能评价 和质量保证,一、校准 (一）校准品的来源 （二）校准方法 二、性能评价和验证 （一）总体评价 （二）性能评价（P75）,（三）性能验证 目前临床实验室对血液分析仪性能验证的内容主要包括：本底计数、携带污染、批内精密度、日间精密度、线性、正确度、不同吸样模式的结果可比性、实验室内的结果可比性、准确度等。,1.本底计数 本底即空白限。用稀释液作为样本在分析仪上连续检测3次，3次检测结果的最大值应在允许范围内。,2.携带污染 分别针对不同检测项目，取一份高浓度的临床样本，混合均匀后连续测定3次；再取一份低浓度的临床样本，混合均匀后连续测定3次。 携带污染率 L1：低浓度样本的第1次测定值；L3：低浓度样本的第3次测定值；H3：高浓度样本的第3次测定值。,3.批内精密度 4.日间精密度 5.准确度,精确度和准确度,5.线性 6.正确度 7.不同吸样模式的结果可比性 8.实验室内的结果可比性,三、质量保证 （一）检测前质量保证 （二）检测中质量保证 （三）检测后质量保证,（一）检测前质量保证 1合格检验人员 2合适的检测环境 3合格的血液分析仪 4合格的配套试剂 5合格的检测标本,（二）检测中质量保证 1仪器启动 2室内质控 （1）商品质控物室内质控法 （2）患者标本