探究针对重金属污染的抵消方案

17学 校：天津市第十四中学项目作者：薛剑 刘心远 刘佳缘指导教师：郝元元 黄辉 高虎31届探究针对重金属污染的抵消方案摘要：环境污染对人类的危害已成为全球关注的焦点问题之一，而重金属污染则由于其危害严重、作用时间长更是引起了人们的关注。本文以铬污染为例，探讨了茶多酚在抵消受重金属胁迫的玉米幼苗生长所产生的影响方面存在的潜在价值。采用水培方法，从玉米种子萌发长至二叶期受铬离子胁迫（0、10-5、10-4mM（单位？） 重铬酸钾）。再将三个浓度下生长的二叶期的幼苗用水冲去培养液（即也去掉重金属作用），每个浓度的幼苗重新分为两组。对照组用清水继续培养，实验组用0.05%茶多酚水溶液继续培养。25天后测定各项指标。在一定浓度下，茶多酚会通过升高SOD(超氧化物歧化酶简称SOD)是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢的酶,可以清除过量的自由基。它广泛存在于各类动物、植物、微生物中，是一种重要的抗氧化剂)和POD(过氧化物酶广泛存在于植物体中,是活性较高的一种酶.它与呼吸作用,光合作用及生长素的氧化等都有关系.在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化.一般老化组织中活性较高过氧化物酶能催化过氧化氢氧化酚类,)活性来抵御铬胁迫，而铬浓度超过一定阈值茶多酚则失去该功能，因此在10-5M铬胁迫的根部和10-4M铬胁迫的茎叶，SOD和POD活性出现升高情况。铬胁迫时以及茶多酚修复时玉米的POD、SOD同工酶表达均发生明显的变化。利用伊文思蓝(evans blue)作为细胞活性染料, 检测了胁迫处理后以及茶多酚修复后的细胞活性。结果显示, 不同浓度铬的胁迫均造成了根和叶片细胞一定程度的伤害。而显微成像也充分表明茶多酚修复作用的有效性。关键词：玉米，重金属铬胁迫，茶多酚，POD、SOD，APX，CAT ，同工酶，伊文思蓝，细胞活性。随着工农业生产的发展，三废的排放，矿产的开发和利用、污水灌溉以及农药、除草剂和化肥的使用等严重地污染了土壤、水质和大气，导致环境恶化。各种工业(如冶炼、电镀、采矿等)废水和固体废弃物的渗出液直接排入水体，致使水体中重金属含量越来越高。铬被称为重金属“五毒”之一，过量铬可以直接或通过食物链危害人类健康，造成严重的致癌、致畸作用1。铬通过运输必需元素(Fe、S、P)的载体以主动运输形式被根部吸收并储存于细胞液泡中，限制了其进一步迁移2。当环境中重金属数量超过某一临界值时就会对植物产生一定的毒害作用。重金属穿过植物细胞膜时，会胁迫植物产生过多自由基而导致氧化胁迫。引起蛋白质和核酸等生物大分子变性以及膜脂过氧化，从而对植物产生伤害。植物体内的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶 (CAT)是植物适应多种逆境胁迫的重要酶类，在清除自由基的过程中发挥着重要的作用，保护细胞免受伤害3。茶多酚可以通过诱导细胞内这些酶的活性而维持抗氧化系统的较高活性或含量，从而有效减少活性氧对叶绿素分子的过氧化损伤，促进蛋白质合成或抑制其分解，缓解了铬对植物的污染胁迫，提高了对铬的耐受性，从而增强植物适应重金属逆境的能力。玉米属C4植物，生长迅速，生物量大，对多种环境因子的胁迫均表现出较强的抗性，是广泛用于重金属污染研究的重要农作物4。本实验以玉米为实验材料，以铬污染为例，探讨了茶多酚在抵消受重金属胁迫的玉米幼苗生长所产生的影响方面存在的潜在价值。1.材料与方法1.1 植物培养及处理： 用9寸白瓷盘铺上三层纱布将玉米均匀的播撒在其上，每盘100粒。用含0、10-5、10-4mM 重铬酸钾、1/2 Hoagland营养液浇灌，每天浇灌一次，使其保持湿润的状态。同时也保持重铬酸钾浓度恒定。处理6天后将出芽的种子移盆水培，15天后测定各项指标。此时玉米幼苗已长至二叶期。再将三个浓度下生长的二叶期的幼苗用水冲去培养液（即也去掉重金属作用），每个浓度的幼苗重新分为两组（每组设多个平行）。对照组用清水继续培养，实验组用0.05%茶多酚水溶液继续培养。25天后测定各项指标。1.2形态指标测定 测定前从盆中取出玉米幼苗，用蒸馏水清洗，表面残留的水分用滤纸吸干，测定总的鲜重。从根茎结合部将其分开，再分别测定其鲜重。每个处理随机选取十株幼苗平展，用直尺测量其根长以及茎、叶长。1.3生理生化指标测定 将已称好的样本剪碎，放入研钵中，根据鲜重加入一定体积的100 mM 磷酸缓冲液（PBS），pH=8.0，研磨成浆。实验中10-5、10-4mM 重铬酸钾处理的茎叶用10 ml PBS提取，其它样本用5 ml PBS提取。倒入离心管中，3500 r/min，离心15 min，分离上清液备用。 可溶性蛋白含量的测定采用考玛斯亮蓝染色法。超氧化物歧化酶（SOD）酶活的测定采用氮蓝四唑（NBT）光化还原法 。过氧化物酶（POD）酶活的测定采用愈创木酚法。过氧化氢酶（CAT）酶活和抗坏血酸过氧化酶（APX）的测定采用紫外比色法5-6。 同工酶广泛存在于生物界中，是功能相同但结构不同的一组酶。由于其结构中氨基酸序列或组成有差异，所以同工酶的电泳迁移率存在差异。同工酶的电泳图谱可以从分子水平上反应出细胞所表现的明显的种属组织和发育阶段的特异性，既是生理指标，又是可靠的遗传标志7。1.4细胞活性的测定 采用伊文思蓝染色法。其原理在于伊文思蓝能够与蛋白结合形成伊文思蓝蛋白复合物。正常细胞膜不能透过伊文思蓝, 当细胞受到损伤后, 伊文思蓝进入细胞并与蛋白结合, 使其染成蓝色8-9。1.5统计分析方法及作图 采用SPSS version 18.0 统计软件进行统计分析，作图使用MicrosoftExcle、PowerPoint。2.结果与分析2.1 生长状况 如图1所示，不同铬浓度处理时，鲜重、根长、苗长均低于对照，再经0.05%的茶多酚处理后，鲜重、根长、苗长均高于对照。说明在一定铬浓度范围内胁迫的玉米幼苗再经0.05%的茶多酚处理后鲜重及生长指标有明显改善。茶多酚有拮抗重金属胁迫的作用。根据SPSS分析表明，与对照组相比茶多酚对被铬胁迫的根的作用（只在0和10-5铬浓度胁迫下）有显著差异(p0.05)。茶多酚对有无铬胁迫的苗的作用均有显著差异(p0.05)。图1 不同铬浓度对玉米鲜重的影响Figure 1 Effect of various chromium stress on the average fresh weight of maize2.2 生理生化指标2.2.1可溶性蛋白含量 如图2所示，根中的可溶性蛋白含量在不同铬浓度胁迫下先升后降，再经0.05%的茶多酚处理后均高于对照组。但叶中的可溶性蛋白含量在不同铬浓度胁迫下持续升高，再经0.05%的茶多酚处理后均高于对照组。根据SPSS分析表明，与对照组相比茶多酚对被铬胁迫的根的作用有显著差异(p0.05)。茶多酚对有无铬胁迫的叶的作用均有显著差异(p0.05)。图2不同铬浓度对可溶性蛋白含量的影响Figure 2 Effect of various chromiumstress onconcentrations of soluble protein2.2.2 SOD酶的活性 如图3所示，根中的SOD酶活性在不同铬浓度胁迫下先升后降，再经0.05%的茶多酚处理后，10-5明显高于对照组。叶中的SOD酶活性在不同铬浓度胁迫下持续升高，再经0.05%的茶多酚处理后10-4明显高于对照组。根据SPSS分析表明茶多酚对被铬胁迫的根和叶的作用均有显著差异(p0.05)。图3不同铬浓度对SOD酶活的影响Figure 3 Effect of various chromium stress on the activity of SOD2.2.3 POD酶的活性 如图4根中的POD酶活性在不同铬浓度胁迫下先升后降，再经0.05%的茶多酚处理后，只有10-5高于对照组，但整体均低于处理前。叶中的POD酶活性在不同铬浓度胁迫下为下降趋势，再经0.05%的茶多酚处理后，只有10-4高于对照组，但整体均低于处理前。根据SPSS分析表明与对照组相比茶多酚对被铬胁迫的根和苗的作用均有显著差异(p0.05)。图4不同铬浓度处理的样品POD酶活的比较Figure 4 Effect of various chromiumstress on the activity of POD2.2.4 CAT酶的活性 如图5所示，根中的CAT酶活性在不同铬浓度胁迫下先升后降，再经0.05%的茶多酚处理后，先降后升，只有10-5明显低于对照组。叶中的CAT酶活性在不同铬浓度胁迫下为先降后升趋势，再经0.05%的茶多酚处理后，先升后降。只有10-5明显高于对照组。根据SPSS分析表明与对照组相比茶多酚对被铬胁迫的根和叶的作用（只在10-5铬浓度胁迫下）有显著差异(p0.05)。图5不同铬浓度对CAT酶活的影响Figure 5Effect of various chromiumstress on the activity of CAT2.2.5 APX酶的活性 如图6所示，根中的APX酶活性在不同铬浓度胁迫后再经0.05%的茶多酚处理，先升后降，加茶多酚的实验组均明显低于对照组。叶中的APX酶活性在不同铬浓度胁迫再经0.05%的茶多酚处理后为先降后升趋势，加茶多酚的实验组均明显高于对照组。根据SPSS分析表明与对照组相比茶多酚对被铬胁迫的的作用均有显著差异(p0.05)，但对根的作用（只在10-4铬浓度胁迫下）有显著差异(p0.05)。图6不同铬浓度对APX酶活的影响Figure 6 Effect of various chromiumstress on the activity of APX2.2.6 SOD同工酶的电泳图谱 比较玉米根和叶中的SOD同工酶的谱带，条带数量不同，说明SOD同工酶在不同的器官中表达不同。在根中，前期铬处理后，箭头标注的条带10-5处最亮；后期经茶多酚对比处理后，箭头标注的条带10-4处最亮。在叶中，前期铬处理后以及后期经茶多酚对比处理后，箭头标注的条带的亮度随浓度的升高而逐渐变亮。红圈所示部位有新的条带出现。图谱显示结果与SOD酶活性测定结果一致。图7 SOD同工酶谱及示意图Figure 7 Thezymogram and schematic diagram of SOD 2.2.7 POD同工酶的电泳图谱 比较玉米根和叶中的POD同工酶的谱带，条带数量不同，说明POD同工酶在不同的器官中表达不同。在根中，前期铬处理后，箭头标注的条带颜色随浓度的升高而逐渐变浅；而后期经茶多酚对比处理后，情况正好相反，箭头标注的条带颜色随浓度的升高而逐渐加深。红圈所示部位有新的条带出现。 在叶中，前期铬处理后，箭头标注的条带颜色随浓度升高A条带逐渐变浅，B条带逐渐加深；后期经茶多酚对比处理后，箭头标注的条带的颜色均随浓度的升高而逐渐加深。红圈所示部位有新的条带出现。图谱显示结果与POD酶活性测定结果一致。图8 POD同工酶谱及示意图Figure 8 Thezymogram and schematic diagram of POD2.3 细胞活性指标2.3.1玉米根的显微图像 前期铬处理的玉米根部结构在10-4浓度下已明显出现破损。而后期经茶多酚处理后，损坏程度明显减小。可见茶多酚的修复效果。图9不同胁迫处理下玉米根的照片及细胞活性Fig.9Pictures and cell viability in root of maize under different stresses2.3.2 玉米叶片在不同胁迫条件下的伊文思蓝染色情况。 从图片中可以看到, 前期叶片经不同铬浓度胁迫处理后, 蓝色染色区域随着处理梯度增加而增大。染色深度也有一定程度的增加。尤其是输导组织部位染色程度最深。然而后期经茶多酚处理后，蓝色染色区域明显缩小，染色深度也变浅，可见茶多酚的修复效果。图10不同胁迫处理下玉米叶片的伊文思蓝染色照片及细胞活性Fig.10 Evans blue dyeing pictures and cell viability in leaves of maize under different stresses3.结论 茶多酚是茶叶中的多酚类物质，来源广泛且价格便宜。它没有任何毒性，对人体有很多益处。例如，它是一种强抗氧化剂，可清除人体内的自由基；还可以防止辐射损伤，已被应用于减轻放疗的不良反应。同时，由于茶多酚具有多个酚羟基，与金属有很强的配位络合作用，使其形成沉淀从而可消除重金属污染。而且在一定浓度下，它还可以促进植物抵抗重金属污染的能力。由于这些特点，使茶多酚具备了可快速恢复土壤的农业价值的特点，且该法价格便宜，具有一定的可行性。 植物体内抗氧化酶可以清除活性氧，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶（CAT）作为植物体内抗氧化酶系统的重要组成部分，在清除自由基方面发挥了重要作用。SOD、POD、CAT三者协调一致，共同完成活性氧类的清除。除了抗氧化酶系统之外，植物体内还存在膜保护物质，其中抗坏血酸是一种重要的膜保护物质，抗坏血酸能清除多种活性氧，抑制不饱和脂肪酸氧化，防止降解，对稳定膜结构十分重要。因此，在重金属胁迫条件下，植物体通过SOD、POD、CAT及其它抗氧化物质清除活性氧自由基，保护细胞膜结构。 在没有铬胁迫的情况下，加入茶多酚会降低蛋白浓度以及抗氧化酶（SOD，POD和CAT）的活性；而在10-5M铬胁迫下，茶多酚会使得根和叶的蛋白浓度升高，同时对根部SOD活性有明显提升作用，未导致POD活性明显变化，而SOD是抗氧化第一道防线，其活性升高可明显抵御铬胁迫造成的氧化损伤，茎叶部分除CAT活性升高外，其余与未加铬时茶多酚对酶活性影响一样，其原因可能是大量铬积累于根部，茎叶部分受的影响较小导致；在10-4M铬胁迫下，根部SOD与POD活性加茶多酚也呈下降趋势，CAT活性不变，而茎叶部分SOD与POD活性呈上升趋势，CAT活性也保持不变，其原因可能为：在一定浓度下，茶多酚会通过升高SOD和POD活性来抵御铬胁迫，而铬浓度超过一定阈值茶多酚则失去该功能，因此在10-5M铬胁迫的根部和10-4M铬胁迫的茎叶部分，SOD和POD活性出现升高情况。 我们还发现, SOD同工酶以及POD同工酶的电泳图谱显示结果与SOD酶以及POD酶活性测定结果相一致。另外从玉米根的显微成像以及玉米叶片在不同胁迫条件下的伊文思蓝染色情况来看，也很好的佐证了这一点。重度铬胁迫可造成根变软以至于部分溃烂, 推测细胞壁骨架和膜结构受到严重的伤害10。 正常叶片具有很低的伊文思蓝染色水平, 受到不同浓度铬胁迫后, 玉米幼苗的全叶片染色水平均逐步上升, 显示了较好的重复性。重金属胁迫后再经茶多酚处理，染色水平均明显降低，证明茶多酚的修复效果明显。 参考文献：1 徐衍忠，秦绪娜，刘祥红 铬污染及其生态效应J环境科学与技术，2002，25:8-10.XU Yan-zhong,QINXu-na,LIU Xiang-hong,etal.The study of chromium pollution and 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