实时荧光定量PCR实验结果分析.ppt

实时荧光定量PCR实验结果分析,邓椋爻 技术支持 广州市昊洋贸易有限公司,定量分析 绝对定量 相对定量,定量PCR应用,定性分析 SNP分析，基因扫描 阴阳性判定 熔解曲线分析,绝对定量：How Many 优点：给出目标基因初始模板的绝对数量，数据容易处理 缺点：必须有标准品，做标准曲线 应用：病毒拷贝数；转基因的拷贝数；转基因成分百分含量检测,绝对定量与相对定量,相对定量:How Much 优点：需要/不需要标准品；使用广泛 缺点：数据理解困难 应用：差异表达分析；芯片评估,14500 copies,108,106,102,104,绝对定量,108,106,102,104,绝对定量,绝对定量,108,106,102,104,绝对定量,105 copies/well,绝对定量,1/3,Blank,1/3,1/3,1/3,1.11 ng/2ul,0.37 ng/2ul,0.12 ng/2ul,10.0 ng/2ul,3.33 ng/2ul,相对定量,Control CT = 21.3 Sample A CT = 22.8 Sample B CT = 19.3,相对定量,Control CT = 21.3 = 1.5ng / tube 1 Sample A CT = 22.8 = 0.5ng / tube 0.33 Sample B CT = 19.3 = 6.0ng / tube 4,Fold,相对定量,相对定量数据处理,管家基因校准(Normalization Gene) 得出每个细胞中的目的基因 目标基因vs. 管家基因 对照样品校准(Calibrator Sample) 得出相对于某个样品的基因表达量, 1X sample. 处理的vs. 未处理的，6hr vs. 0 hr, 病理vs. 正常.,按比例稀释标准品，根据标准曲线确定样本初始模板浓度 至少需要两个标准曲线 GOI reference gene 标准曲线确定反应扩增效率,相对定量标准曲线,相对定量,相对定量：CT法,依据：平均相对含量% = 2 平均CT 数据处理： C（t）GOI- C（t）ref= C（t） C（t）sample- C（t）calibrator= C（t） 好处：不做标准曲线 应用范围：扩增效率较高，目标基因和内标基因扩增效率一致并且相互独立扩增；不做标准曲线，高通量检测（芯片评估）；不要求很高的精度,应用实例-基因表达分析,利用TaqMan技术研究ERBB2 在乳腺肿瘤 组织标本中的表达差异,实验设计流程,Aurum Total RNA kit,iScript cDNA Synthesis Kit,材料和方法,已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常，因此可以作为一个检测标准 选用GAPDH作为内标基因 FAM标记的ERBB2探针 VIC标记的GAPDH探针 标准品（质粒）构造标准曲线 多重PCR反应 阴性对照 无RNA对照（空白） 无逆转录酶对照（监控基因组污染）,RNA定性及定量分析,一步法两步法,在不同的反应管中运行RT & PCR,25C 5 min 42C 30 min 85C 5 min 冷却至4C,iScript cDNA Synthesis Kit,设计qPCR实验方法,5-6oC Below,10oC Above,PCR优化-温度确定,预设退火温度,PCR优化-熔解曲线,PCR优化-扩增曲线,RT-qPCR实验,95C,15min 94C,15sec 60C,1min plate read go to step 3,39 more times 10C,forever End,目标基因： 未知样品 生成标准曲线： 标准品梯度 监控系统故障： 阳性对照 监控污染： 阴性对照/基因组对照 校准生物学误差：看家基因 降低其余误差： 重复实验,结果分析-绝对曲线,Color 2 - VIC detection for GAPDH,Color 1 FAM detection for ERBB2,结果分析-单双通道相互验证,ERBB2单双通道相互验证的实验结果,结果分析-扩增曲线,样品扩增：正常vs肿瘤,PMT1-FAM detection- ERBB2,PMT2-VIC detection- GAPDH,肿瘤,肿瘤,正常,Healthy RNA,Tumor RNA,GAPDH,ERBB2,1095 1052,2130 2492,95500 85730,136000 130800,Copies ng/ l Total RNA,ERBB2 copies / GAPDH copies,1095 / 95500 = 0.011 1052 / 85730 = 0.012,2130/136000 = 0.017 2492/130800 = 0.0197,Healthy RNA,Tumor RNA,0.011,0