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仪器分析 第13讲 质谱分析法,朱永法 清华大学化学系 ,2,2002 Nobel Prize in Chemistry,Koichi Tanaka Shimadzu Corporation,John Fenn Virginia Commonwealth University,质谱在生物分析上的突破生物质谱,3,质谱仪的发展简史,1912年： 世界第一台质谱装置 1940年代: 质谱仪用于同位素测定 1950年代：分析石油 1960年代：研究GC-MS联用技术 1970年代：商品GC-MS出现，计算机引入， GC-MS技术基本成熟 1980年代：大气压电离的LC-MS出现 1990年代：基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪出现；质谱技术大量用于生物医药领域，出现“生物质谱”概念,4,质谱分析概念,质谱分析法： 是通过对被测样品离子的质荷比的测定来进行分析的一种分析方法。 质谱分析原理： 被测样品首先进行离子化，然后利用不同质荷比的离子在电场，磁场中运动行为的差异进行分离，最后通过检测仪进行分析，得到被测物质的质量和结构信息。 质谱分析法的应用： 化学，生物，化工，材料，环境，医学等方面；,5,质谱仪的分类,有机质谱仪： 1）气相色谱-质谱联用仪 2）液相色谱-质谱联用仪 3）其他质谱仪 傅立叶变换质谱仪 基质辅助激光解吸-飞行时间变质谱仪 无机质谱仪：ICP-MS，SIMS 同位素质谱仪：轻元素同位素，重元素同位素 气体分析质谱仪,6,有机质谱仪组成及工作原理,包括：离子源，质量分析器，检测器，真空系统等,7,离子源(ion source),1 电子电离源(electron ionization，EI) 2 化学电离源(chemical ionization，CI) 3 快原子轰击(fast atom bombardment，FAB) 4 电喷雾源(electronspray ionization，ESI) 5 大气压化学电离源（atmospheric pressure chemical ionization，APCI) 6 基质辅助激光解吸电离源（matrix assisted laser desorption ionization，MALDI),8,电子电离源（EI）,原理：样品以气体形式进入离子源，灯丝发出的电子轰击样品分子使之发生电离；一般电离电压：70eV 1、样品分子在电子轰击下，可以失去一个 电子 形成分子离子，也可能化学键断裂形成碎片离子；分子离子给出分子量，碎片离子给出分子结构信息； 2、EI源碎片离子多，结构信息丰富，有标准化合物质谱库 3、样品在气态下电离，不能汽化的样品不能分析，主要用于气-质联用仪 4、有些样品得不到分子离子,9,电子电离源(electron ionization EI),工作稳定可靠 结构信息丰富 标准谱库 易挥发性物质； 不是全部可以获得分子离子,10,化学电离源 (chemical ionization CI),化学电离源：利用灯丝发出的电子和反应气体作用形成分子离子，而该分子离子可以继续和样品分子发生作用，形成样品的分子离子； CH4+eCH4+CH3+CH2+CH+C+ CH4+CH4CH5+CH3 CH3+CH4C2H5+H2 CH5+XHXH2+CH4 C2H5+XHX+C2H6 特点：得准分子离子，得不到标准质谱，适合易于气化的有机样品分析,11,邻苯二甲酸二辛酯的 EI 和 CI 质谱图,12,快原子轰击,原理：气体在电离室放电形成高能离子，高能离子经过电荷交换得到高能原子流，快原子(Ar或Xe）轰击到样品就产生样品离子。 特点： 适用于极性强，难汽化，热稳定性差，分子量大的化合物分析，如肽类，低聚糖等 得准分子离子，如（M+H)+、（M+Na)+碎片离子很少 FAB一般用作磁式质谱的离子源,13,快原子轰击,14,电喷雾源 (electronspray ionization ESI),原理：喷雾蒸发，在蒸发过程中表面电荷密度增加，超过临界值后，离子就可以从表面蒸发出来，通过加速电压进入分析器；,15,电喷雾源(ESI)特点,电喷雾源属软电离技术，只产生分子离子，不产生碎片离子； 产生的离子常带有多电荷，尤其是生物大分子 适用于强极性，大分子量的样品分析；如肽，蛋白质，糖等 主要用于液相色谱-质谱联用仪,16,17,大气压化学电离源,通过放电使空气中的中性分子产生离子，这些离子与样品分子进行离子分子反应，使样品分子离子化的过程； 适合中等极性化合物的分析，主要获得准分子离子信息；,18,基质辅助激光解吸电离 （matrix assisted laser Desorption ionization，MALDI),原理：利用一定能量的脉冲激光器辐照样品，使样品产生电离的方式。被分析的样品放置在涂有基质的靶上，在激光辐照过程中，基质分析吸收并转递激光能量，与样品分子一起蒸发到气相并使样品分子电离。 基质：2,5二羟基苯甲酸，芥子酸，氰基4羟基肉桂酸 信息：分子离子，准分子离子，碎片信息很少； 适用于生物大分子的分析,19,大肠杆菌蛋白的MALDI-TOF 分析,20,质量分析器(mass analyzer),单聚焦分析器（single focusing mass analyzer） 双聚焦分析器（double focusing mass analyzer） 四极杆分析器 (quadrupole analyzer) 离子阱分析器 (Ion trap) 飞行时间分析器(time of flight，TOF） 傅立叶变换离子回旋共振（Fourier tranform ion cyclotron resonance）,21,单聚焦分析器 single focusing mass analyzer,结构： 扇形磁场（可以是1800, 900, 600等）,22,单聚焦分析器特点,离子的m/z大，偏转半径也大，通过磁场可以把不同离子分开 在一定磁感应强度B下，改变加速电压V可以使不同离子先后通过检测器，实现质量扫描，得到质谱。 结构简单，操作方便，质量分辨率低,23,双聚焦分析器 （Doubpe focusing mass analyzer）,24,双聚焦分析器,结构：磁场 电场 原理：单聚焦分析器分辨率低的主要原因在于它不能进行能量聚焦。 能量聚焦 方向聚焦 特点：分辨率高 操作复杂,25,四极杆分析器 (quadrupole analyzer),26,四极杆质谱分析器原理,结构：四根棒状电极，形成四极场 1，3棒：(Vdc+Vrf) 2，4棒：(Vdc+ Vrf ) 原理：在一定的Vdc/Vrf下 ， 只有一定质量的离子可以通过四极场，到达检测器，其他质量的离子碰到四极杆被吸收，在另外的Vdc/Vrf下可接收到另外质量的离子。在一定的Vdc/Vrf)下，连续改变Vrf或Vdc可实现质量扫描 特点：扫描速度快，灵敏度高；适用于GC-MS,27,离子阱分析器 (Ion trap),28,离子阱分析器 (Ion trap),离子阱的原理和四极杆质量分析器很相似，采用同样的离子运动方程； 在稳定区，离子可以常时间留在阱里； 可以通过电极上的负电压，将离子从阱中引出，进行检测； 在恒定的U/V下扫描V就可以获取不同质量的谱； 特点：结构小巧，质量轻，灵敏度高； 可应用于GC-MS,LC-MS,29,飞行时间分析器 (time of flight analyzer）,30,飞行时间质谱,通过离子在漂移管中的自由漂移，进行质量分析的方法； 离子在漂移管中的飞行时间与离子质量的平方根成正比； 特点：质量范围宽，扫描速度快，不需要电场和磁场； 应用：GC-MS，LC-MS,31,检测器(detector) 电子倍增器,32,真空系统（Vacuum system）,机械泵 扩散泵 分子涡沦泵,33,GC和MS联用的优点,GC：善于分离，不善于定性 MS：善于定性，不善于分离 GC-MS：分离，定性同时进行,34,气相色谱-质谱联用仪 （ GC-MS ),GC-MS组成： GC ：填充柱 毛细管柱均可 MS ：常用四极杆质谱仪 近来还有离子阱和飞行时间质谱仪 接口： 填充柱: 须用分子分离器 毛细管柱:直接插入质谱仪的离子源 数据系统：计算机 数据库,35,气相色谱-质谱联用仪 （ GC-MS ),GC-MS工作方式 混合物通过GC进样 GC分离成单一组份进入MS MS将样品电离并得到质谱 计算机采集质谱 GC-MS的主要信息 总离子色谱图 提取离子色谱图(质量色谱图） 质谱图 检索结果,36,液相色谱-质谱联用仪,LC-MS组成： LC ： 一般LC MS ：常用四极杆质谱仪， 离子阱质谱仪， 飞行时间质谱仪， 串联质谱仪（tandem mass spectrometer) 接口：大气压电离源，包括： 电喷雾源（electrospray ionization, ESI） 大气压化学电离源 (atomospheric pressure chemical ionization, APCI),37,LC-MS工作方式,混合物通过LC进样 LC分离成单一组份进入MS MS将样品电离并得到质谱 计算机采集质谱,38,LC-MS的主要信息,总离子色谱图 提取离子色谱图 质谱图:只有准分子离子峰 串联质谱法： 串联方式：Q-Q-Q Q-TOF 主要信息：子离子，母离子，中性丢失离子；,39,其它质谱仪 傅立叶变换质谱仪 基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪 质谱仪主要技术指标： 质量范围 分辨率 灵敏度 质量稳定性，质量精度,40,质谱解析基础知识,质谱中的离子 分子离子：在电子轰击下，有机分子失去一个电子所形成的离子； 碎片离子：是由分子离子碎裂而成； 自由基引发的断裂（ 断裂） 正电荷引发的断裂（i 断裂) 断裂 同位素峰 重排离子,41,各类化合物的质谱图,烃类 醇类 醛和酮 酯和酸 苯及其衍生物,42,质谱解析,质谱解析步骤 计算不饱和度 确定分子量 由高质量端确定取代基 由低质量端寻找特征离子系列 由结构单元给出可能的结构,43,质谱解析举例,例1：某未知化合物质谱图如下图所示，给出结构式分子式：C8H8O2,MW=136 -OCH3: 31 -C=O : 28 -C6H5: 77,44,质谱解析举例,解析： 分子式：C8H8O2 分子量M=136； 不饱和度 U=8-8/2+1=5 m/z=77,51，苯环 m/z105，136-105=31（CH2OH,OCH3） m/z105-77=28（CO),45,质谱解析举例,例2：某未知化合物质谱图如下图所示，给出结构式,46,质谱分析法的应用,GC-MS联用分析 GC-MS定性分析 1)分析条件的设定 GC条件：同普通GC MS条件：扫描方式，扫描范围， 扫描速度, 灯丝电流，倍增器电压等 2)定性分析 数据的采集：进样，电离，质谱数据的采集,47,GC-MS定量分析,GC-MS定量分析依据： 用总离子色谱图定量 用质量色谱图（提取离子色谱图）定量 用选择离子色谱图定量 GC-MS定量分析方法： 外标法 内标法 GC-MS分析举例 中药成分分析： 样品制备 GC-MS条件 进样,48,应用举例,49,50,LC-MS的应用,LC-MS定性分析 分析条件的选择： LC条件的选择、电喷雾条件、MS条件 定性分析 分子量确定：（M+1）（M-1） 多电荷 MS-MS联用测定子离子谱 LC-MS定量分析 质量色谱图 多反应监测（MRM） 生物质谱技