WATERS公司的UPLC-TQD培训资料MS1LCMS基础.ppt

液质联用基础知识,什么是质谱(Mass Spectrum),不同质荷比的离子经质量分析器分离,而后被检测并记录下来的谱图叫作质谱图.简称质谱 质谱图的横坐标是质荷比(m/z)，纵坐标是离子强度 质谱法(Mass Spectrometry)即质谱分析法,一般亦简称为质谱,氯霉素的质谱图,MS 检测的是离子质量,质谱基础知识,质谱中采用的质量单位 Da=Dalton (道尔顿 ) 质量单位,等于一个碳原子(12C)质量的十二分之一，约为1.6610 -24克;一克约为610 23道尔顿 amu=atomic mass unit ,原子质量单位 1amu=1Da,质谱基础知识,同位素: 具有相同的原子序数而又具有不同的质量数 的原子叫作同位素 同位素丰度: 自然界中某同位素原子所占的百分数叫做该同 位素的天然丰度,同位素表示法,C,12,6,C,13,6,质量数 = 质子 + 中子,原子序数 = 质子数,具有相同的元素符号,在元素符号的左上角表明其质量数,天然同位素丰度,怎样计算质量数,名义质量数 采用元素质量数的整数进行计算,例如:C=12,H=1,O=16 单同位素质量数或准确质量数 用丰度最大的同位素准确质量数计算 例如：C=12，1H=1.0078，16O=15.9948 平均质量数或化学质量数 考虑到所有天然同位素丰度的该元素原子量来计算 例如：C=12.001，H=1.00794，O=15.9994 质谱获得的单电荷离子的m/z值，是单同位素质量数,MS分子量的计算,利血平, C33H40N2O9,的MW的计算,使用原子量: 使用单一同位素质量: C: 33 x 12.011 = 396.363 C: 33 x 12.0000 = 396.000 H: 40 x 1.0079 = 40.316 H: 40 x 1.0078 = 40.312 N: 2 x 14.0067 = 28.013 N: 2 x 14.0031 = 28.006 O: 9 x 15.9994 = 143.995 O: 9 x 15.9949 = 143.954 608.687 608.272,质谱名词与术语,质荷比(mass charge ratio): 离子的质量(以相对原子量单位计)与它所带电荷(以电子电量为单位计)的比值,叫作质荷比,简写为m/z 质荷比是质谱图的横坐标 质荷比是质谱定性分析的基础,离子丰度 (Abundance of ions): 检测器检测到的离子信号强度 离子相对丰度 (Relative abundance of ions): 以质谱图中指定质荷比范围内最强峰(基峰)的强度为100, 其它离子峰对其归一化所得的强度 标准质谱图均以离子相对丰度值为纵坐标 谱峰的离子丰度与物质的含量相关,因此是质谱定量的基础,质谱名词与术语,MS是高真空技术,质谱仪之所以在高真空下工作是为了 . 尽量减少离子-分子之间的碰撞 (即,得到最大平均自由程) 碰撞可能导致离子偏离所期望的由离子源到检测器的通道 碰撞可能导致产生意外的离子或反应 平均自由程:1 atm10 -6 m ; 10-4 torr 0.5 m 防止在高电压 (用于某些离子聚焦)下生成电弧 减少污染/化学噪音,MS的历史,1910年 世界上第一台现代意义质谱仪在英国剑桥 Cavendish实验室出现 1917年 电喷雾(Electrospray) 物理现象被发现 (并非 为了 MS) 1918年 世界上第一台实际意义质谱仪在美国芝加哥 大学实验室出现(扇型磁场MS) 1943年 世界上第一台商业质谱仪 1953年 四极杆质量分析器质谱仪 1955年 飞行时间质量分析器质谱仪 1960s 开发GC/MS,MS的历史,60s-70s 大气压电离(APcI)源被发现(但并未被广泛 应用) 70s-80s 开始广泛研究 LC/MS 1979年 传送带式 LC/MS 接口成为商业产品 1982年 离子束LC/MS接口出现 1984年 第一台电喷雾 MS仪宣告诞生 1988年 电喷雾离子源 MS 首次应用于蛋白质的分析 .,质谱的分类,按离子源的种类分 EI (电子轰击源)质谱(常用于GC-MS系统) API (大气压电离源)质谱(常用于LC-MS系统) MALDI(基质辅助激光解吸电离源)质谱(常用于生物大分子分析) 按质量分析器的种类分 四极杆(Quadrupole)质谱 离子阱(Ion Trap)质谱 飞行时间(Time of Flight,TOF)质谱 扇形磁场(Magnetic Sector)质谱 ,什么是液质联用(LC/MS),LC/MS=LC+MS,LC/MS中的液相色谱,High Performance Liquid Chromatography(HPLC) -高效液相色谱 Ultra Performance Liquid Chromatography(UPLC) -超高效液相色谱 液质联用的前提和基础=进样+分离 根据化合物的化学特性分离样品(比如极性化合物，非极性化合物，酸性化合物，碱性化合物等等) LC的特点:分离技术 分离效率高 流动相参与分离 连续流出,峰宽有限 有时需要使用缓冲盐提高分离度 高压环境工作( 1000 psi),LC/MS中的质谱,Mass Spectrometry-质谱 质量是物质固有特征之一，不同的物质有不同的质量谱 分析物被转化为气相离子而被分析 这些离子按其质荷比 (m/z)被分离而被检测 质谱图即是相关的离子流对m/z的图 MS的特点 灵敏度高 定性/定量本领高 脉冲扫描采集数据 高真空环境工作 溶剂参与反应(API电离源),LC/MS 数据形式,TIC色谱,保留时间,TIC,为什么使用 LC/MS? 丰富的结构信息(1),API,为什么使用 LC/MS? 极高的灵敏度 (2),5 个数量级的动态线性范围 (0.1pg - 1000pg) 实验系数= 0.9975,样品:磺胺二甲氧哒嗪上柱分析,为什么使用 LC/MS? 极佳的定量结果(3),为什么使用 LC/MS? 进一步增加HPLC的分离能力(4),如果让您来选择，您满意那一种分离度?,为什么使用 LC/MS? 解决无UV吸收样品分析问题(5),两种 LC/MS 系统示意图,高真空部分,高真空部分,样品引入,样品引入,EI电离源,API电离源,LC/MS联用的难点,进样方式比较 对真空泵的要求 * (liters/sec) 毛细管 GC, 1mL/min (气体) 400 微柱 LC, 10 L/min 5,000 填充柱 LC, 1 mL/min 50,000 *为了保持 3 x 10-6 torr (4 x 10-6 mbar)的真空,LC/MS 接口必须使LC流出的液流达到 MS 可接受的压力(10-5 - 10-6 torr) 同时以极小的谱带展宽尽可能多地输送样品离子到MS,LC/MS联用关键技术接口,液相色谱的出口情况: 从液相色谱流出的组分存在于大气压条件下的溶液之中 质谱的入口情况: 在高真空工作条件下的质谱仅接受气相离子 因此液质联用的接口必须完成三个转变: 物态转变: 液态 - 气态 带电状态: “中性” - 离子 真空变化: 760 torr - 10-5-10-8 torr(乇) 要求:雾化,去溶剂和电离同时完成,API LC/MS 的 Z-Spray接口,Z-Spray 接口技术,苯海拉明, 10mM 磷酸盐缓冲液,MS的电离技术,质量过滤器,样品引入,质谱的种类及相关联用技术,离子分离模式 质量分析器 离子检测 数据的采集及处理,样品的引入模式 溶剂的去除或抽 真空方式 质子化模式,同一个样品的质谱图可能不一样,传统的样品电离方式：EI源,EI源：电子轰击电离源 可得经典的质谱谱图 可查询质谱库，质谱结果可用工业标准谱库检索，是绝对的化合物鉴定 相对易得，耐受性好 谱图可解析,阐明结构信息 但是,电离效率较差，测定的分子量范围、流速范围有限；可测的化合物类型有限,EI 谱库:几十年积累的宝贵财富,High Res Mass Spec, Brown, Kamano, Pettit, Org. Mass Spec., 1972,Waters Integrity LC/MS System, Pfizer, 1996,大气压电离 (API) 技术,电喷雾电离 Electrospray Ionization ESI 大气压化学电离 Atmospheric Pressure Chemical Ionization - APCI,电喷雾(ESI) 离子化过程,电喷雾离子化可分为三个过程: 形成带电小液滴 溶剂蒸发和小液滴碎裂 最终形成气相离子,ESI的特点,低分子量化合物一般产生单电荷离子(失去或得到一个质子) 高分子量生物大分子和聚合物产生多电荷离子 几乎没有碎片离子 可能生成加合物和/或多聚体 常见的是溶剂加合物和NH4+(M+18), Na+(M+23),和K+(M+39) 加合物 灵敏度取决于化合物本身和基质,ESI+ 电离模式,灭多虫 MW 162,产生 M+H+ 准分子离子峰,大气压化学电离 (APCI)过程,大气压化学电离可分为以下两个步骤: 快速蒸发 气相化学电离(电晕放电),APCI的特点,一般而言, 只生成单电荷离子 几乎没有碎片离子 可能生成加合物和/或多聚体; 一般是溶剂加合物及NH4+ (M+18), Na+ (M+23), 和 K+(M+39)加合物 基质影响较小 (相对于ESI), 质谱图不受缓冲盐及其缓冲力变化的影响,API与传统电离技术的区别,高真空部分,高真空部分,样品引入,样品引入,EI电离源,API电离源,不同电离技术的适用范围,分子量,液质联用系统的质量分析器,质量过滤器,样品引入,A. 磁质谱,通过磁场和电场来传输和选择离子,B. 飞行时间质谱,所有离子一同起跑 质量小的跑得快 时间分辨,C. 四极杆质量分析器,被分析离子由DC和RF电压控制,D. 离子阱,原理与四极杆类似 离子被 RF & DC 电场所储存 扫描电场可以释放特定的m/z离子,分析器 m/z范围 分辨率 质量精度 动态范围 真空 四极杆 103 103 0.1% 105 10-5 离子阱 103 103-104 0.1% 104 10-3 飞行时间 106 103-104 0.1-0.01 % 104 10-6 扇形磁场 104 105 5ppm 107 10-6 回旋共振 105 106 10ppm 104 10-9,质量分析器特性,质谱分辨率的定义,传统分辨率的计算公式: 分辨率R = m/m m于 5% 峰谷处测定 现今: m= FWHM处,分辨率:质谱上是指分开相邻离子的能力 分辨率越高,越能区分小的质量差,什么是单位质量分辨率,m/m = 133/0.6 = 222,m/m = 1009/0.5 = 2018,Peak widt