猪链采样与检测ppt丽水市疾病预防控制中心课件

人 感 染 猪 链 球 菌 病 样品采集运送与实验室检测方案,浙江省丽水市人感染链球菌病疫情控制和诊疗技术培训会议,丽水市CDC 兰进权,提纲,病原学简介 样品采集与运送 实验室检测,病原学简介,分类 培养特性 生化特征 致病因子,链球菌分类,伯杰分类 6大类群，29个种 16SrRNA序列同源性和化学分类 链球菌属分类学定义 无芽孢革兰氏阳性细菌，细胞形态为球形或球杆状，直径0.52.0微米，细胞成对或成链排列，有些种具有荚膜。,链球菌分类,根据溶血现象分类 甲型溶血性链球菌：称甲型溶血或溶血，溶血环中的红细胞并未完全溶解。多为条件致病菌。 乙型溶血性链球菌：称乙型溶血或溶血，溶血环中的红细胞完全溶解，致病力强 丙型链球菌：无溶血环，一般不致病 猪链球菌溶血(偶而也有弱溶血或溶血、溶血现象均不明显 ) ，某些菌株在马血培养基上溶血,链球菌分类,根据抗原结构的分类 兰氏分类：按多糖类抗原（C抗原）将链球菌分成A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S和T群(其中缺I、J群) ，近年又增加U、V群，共20群，每个群有1个或多个种。 几乎所有群的菌株，都能从病猪体内分离得到，引起猪病并偶尔经伤口感染人的链球菌主要有 R群的2型猪链球菌 S群和D群的1型猪链球菌 F群的咽峡炎链球菌 L、S、T、U、V群链球菌等,链球菌分类,猪链球菌 血清2型 兰氏分类：R群 根据菌体荚膜抗原特性不同，分为35个血清型：1/2，134型 致病性最强的是2型，其次为1型 2型猪链球菌 1954年英国分离 1968年命名为荚膜II型猪链球菌 分为致病力不同的株,猪链球菌培养特性,革兰氏阳性无芽胞球菌，兼性厌氧 营养要求较高，在普通培养基中生长不良，需补充血液、血清、葡萄糖等 在血清肉汤中易形成长链，管底呈絮状沉淀 在绵羊鲜血琼脂平板上37 培养24小时，形成直径l2毫米的细小菌落，灰白色，半透明，边缘整齐，凸起，光滑，溶血（有时呈弱溶血或溶血不明显），48小时后可有草绿色色素沉着。,猪链球菌培养特性,刚分离的猪链球菌，典型的革兰氏阳性链球菌，链长达二十多个 二代培养后细菌形态不典型，结晶紫作色不良，多为不成链球杆菌，少数呈短链状。,链球菌. Gram stain. CDC/Dr. Richard Facklam,链球菌,猪链球菌培养特性,10培养不生长，45培养生长，6030分钟试验不生长 5530分钟即可被杀死,猪链球菌生化特征,猪链球菌生化特性往往差异较大，一般难以作为分类依据 触酶试验阴性 水解七叶苷、淀粉和精氨酸，不水解马尿酸盐和明胶 分解乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露糖，不分解阿拉伯糖、鼠李糖和甘露醇,致病因子,猪链球菌2型主要致病因子 溶菌酶释放蛋白（muramidase-released protein,MRP） 细胞外因子（extracellular factor,EF） 猪溶素（suilysin） 荚膜多糖 用南通地区分离的人源猪链球菌对兔和小白鼠的攻击试验表明，猪链可使家兔发病，并引起死亡。而小白鼠不敏感,样品采集与运送,采样器材 样品种类 血液和脑脊液标本采集方法 样品运输保存 注意事项,采样器材,无菌封闭性好的试管，最好使用负压采血管或带螺口盖的塑料管，避免使用玻璃试管。 可以清楚标记且标记不易脱落的记号笔。 可以方便采集组织标本的无菌容器。 无菌的剪刀、镊子和手术刀。,采样器材,血平皿(或者血培养瓶)。 一次性隔离服、乳胶手套、防护口罩等 带有冰袋或者冰排的安全可靠的保温运输容器 采样送检单,样品种类,现症病人不抗凝全血 现症病人抗凝血 发病47天、1016天不抗凝血 脑脊液标本 尸体解剖应无菌采集肝、脾、心血、胸（腹）水 如有病死猪也可进行解剖，取肝、脾、肾、心血、肉,血液和脑脊液标本采集方法,无菌抽取血液510ml分置于有抗凝剂和无抗凝剂的无菌试管或者负压采血管中 按常规方法腰穿采集适量脑脊液标本置于无菌试管中 采集标本的同时接种血平皿或者血培养瓶，置于3537培养,样品运输保存,所有的原始标本在转运过程中应置于安全可靠容器中。 标本应冷藏运输。 需要马上检测的标本在实验室可暂放4-8冰箱。 剩余标本放置于-70保存。,注意事项,严格无菌操作，防止标本污染。 用于分离培养的标本应在抗菌治疗前采集。 应尽可能床边接种分离培养，如无法立即接种，应在样品送达实验室后立即进行分离。 在标本采集过程中，注意安全防护。使用一次性隔离服、乳胶手套、防护口罩 采取预防措施，防止针头等锐器刺伤 如发生伤口意外暴露，应及时清洗和消毒，并预防性服药,实验室检测,猪链球菌检验程序 推片镜检 分离鉴定 检测要点,猪链球菌检验程序,病人检样（脑脊液、血液等） 增菌培养 （脑心肉汤/牛血清葡萄糖 肉汤/血培养瓶） 革兰氏染色 触酶试验,推片镜检,猪链球菌检验程序(续),羊血琼脂平板 （37，5%CO2，24h） 溶血(偶而也有弱溶血) PCR检测 血清学检测 生化鉴定,推片镜检,抗凝血或脑脊液可推片革兰氏染色镜检 阳性标本可见中性粒细胞内吞噬颗粒，偶尔可见革兰阳性球菌,感染鼠尾血推片,感染兔心脏血推片,分离鉴定,血平板直接接种 新鲜羊血琼脂平板/含8%新生牛血清的营养琼脂平板 血或脑脊液等标本 直接接种 组织标本 可直接涂抹平板或剪碎用无菌生理盐水洗涤，洗液接种平板 置375% CO2培养箱或者烛缸中培养24小时,分离鉴定,增菌培养 待检标本置约10倍体积脑心肉汤/含8%新生牛血清葡萄糖肉汤（附配方）/商品化血培养瓶中增菌培养37 24小时 增菌培养物接种新鲜羊血琼脂平板，置375% CO2培养箱或者烛缸中培养24小时 如果是污染标本,则要接种于选择增菌培养液（含15微克/毫升多粘菌素B，30微克/毫升萘啶酮酸的脑心培养基）进行增菌,附：葡萄糖肉汤（含8%新生牛血清）,成分： 酵母浸膏 3克 10%葡萄糖溶液 20毫升 枸椽酸钠 3克 磷酸氢二钾 2克 牛肉汤 900毫升 24.7%硫酸镁 20毫升 0.5%对氨苯甲酸 5毫升 新生牛血清 80毫升,附：葡萄糖肉汤（含8%新生牛血清）,制法 除葡萄糖及硫酸镁外,其他各物混合,加热溶解,矫正pH至7.6,再煮沸5分钟 用滤纸过滤并分装于100毫升三角烧瓶内,每瓶50毫升,包扎瓶口,高压灭菌10磅20分钟 将葡萄糖配成10%水溶液,硫酸镁配成24.7%水溶液,分别高压灭菌8磅15分钟 每50毫升无菌肉汤内加入无菌葡萄糖及磷酸镁水溶液各1毫升,混匀.于37培养2天证明无细菌生长后存于冰箱内备用。,分离鉴定,形态学鉴定 挑取平板上可疑菌落革兰氏染色镜检 筛检生化试验 猪链球菌触酶试验阴性，可与葡萄球菌区别 血清学检测 标准分型诊断血清，进行乳胶凝集试验或玻片凝集试验 确定所分离的菌株为R群，与2型猪链球菌分型血清反应 目前国内无分型诊断血清供应。据报道,加拿大和澳大利亚有商品化血清分型试剂。,分离鉴定,生化鉴定 血平板上挑选可疑菌落进行革兰氏染色和触酶试验 符合链球菌特征，接种血平板纯培养后进行生化鉴定 梅里埃API生化鉴定系统API 20 strep可鉴定2型猪链球菌，推荐使用（鉴定程序详见操作说明）,分离鉴定,PCR检测 猪链球菌种特异性基因16S rDNA 猪链球菌2型和1/2型型特异的荚膜多糖基因cps2A 毒力因子溶菌酶释放蛋白基因MRP 细胞外蛋白因子基因EF,基因鉴定，使用PCR技术和对PCR产物进行序列分析 检测猪链球菌种特异性16S rRNA。 上游引物：cagtatttaccgcatggtagatat 下游引物：gtaagataccgtcaagtgagaa,检测猪链球菌荚膜多糖基因（cps2A） 上游引物：gttgagtccttatacacctgtt 下游引物：cagaaaattcatattgtccacc,检测溶菌酶释放相关蛋白编码基因片段（mrp） 上游引物： ggtatacctt gctggtaccg ttc 下游引物：agtctctaca gctgtagctg g,PCR反应的条件： 94预变性5分钟;94、30秒，60、30秒，72、30秒，25个循环，最后延伸72、5分钟。取5微升扩增产物在1.2的琼脂糖凝胶中进行电泳。,Multiplex PCR Assay for Detection of Streptococcus suis Species and Serotypes 2 and 1/2 in Tonsils of Live and Dead Pigs.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, July 2004, p. 31693175,Multiplex PCR Assays for Simultaneous Detection of Six Major Serotypes and Two Virulence-Associated Phenotypes of Streptococcus suis in Tonsillar Specimens from Pigs. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug. 2002, p. 29222929 The cps Genes of Streptococcus suis Serotypes 1, 2, and 9: Development of Rapid Serotype-Specific PCR Assays. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Oct. 1999, p. 31463152,Use of Ribotyping and Hemolysin Activity To Identify Highly Virulent Streptococcus suis Type 2 Isolates. JOURNAL OF CLINICA MICROBIOLOGY, Jan. 1998, p. 1519,检测要点,传代培养后细菌形态不典型,多为革