酶免检测技术原理及影响.ppt

3月18日免疫室差错问题分析及整改措施,3月18日免疫室出现了标本漏检问题，导致病人情绪不满，甚至大吵大闹，给科室形象造成了一定的影响。暴露出了免疫室一些问题，如严格按检测流程执行力度问题，认真细心问题等，同时也违背了免疫室规定的检验报告结果时效性原则和以病人为中心的服务宗旨。 针对上述事件，经免疫室人员讨论、分析，制定出以下整改措施： 1、端正态度、要认真、负责 2、严格执行免疫室检验流程，仔细核对标本，不同批次检测标本 标记清楚 3、增加人员缓解紧张工作状态 4、欢迎大家给出宝贵建议 5、坚持免疫室两个原则,免疫室简介,免疫室简介,免疫室简介,免疫室简介,一、抗原抗体反应 二、酶免疫技术的分类、原理及特点 三、酶联免疫吸附试验 四、ELISA法检测注意事项 五、ELISA法检测常见问题及解决方法,一、抗原抗体反应,抗原抗体反应原理,抗原抗体结合反应是抗原决定簇和抗体分子超变区在化学结构和空间结构上具有互补性，使抗原表位嵌入抗体超变区的槽沟，发生特异性结合，其关系如钥匙和锁。 有四种分子间作用力参与并促使抗原、抗体的结合。,抗原抗体反应原理,氢键结合力,范德华引力,静电引力,疏水作用力,抗原抗体结合力,抗原抗体反应特点及影响因素,抗原抗体反应特点：1、特异性 2、比例性 3、可逆性,抗原抗体反应影响因素： 1、反应物自身因素：抗原 抗体 2、反应环境条件：电解质 酸碱度 温 度,抗原抗体反应影响因素： 1、反应物自身因素： 抗原 理化性状、表位种类、数目 抗体 来源、特异性、亲和性、效价 2、反应环境条件： 电解质 85g/LNaCl溶液 酸碱度 pH6-9为宜 温 度 最适温度为37,二、酶免疫技术的分类、特点及原理,1、酶免技术的分类,.,酶免疫技术,酶免疫组化,组织切片或其它标本中抗原的定位,酶免疫测定,液体标本中抗原或 抗体的定性和定量,均相,异相,固相酶免疫测定,液相酶免疫测定,1、酶放大免疫测定技术EMIT 2、克隆酶供体免疫分析CEDIA,分离结合、游离酶标记物，底物测定,检测微量短肽激素、小分子抗原,最广泛，酶联免疫吸附试验,小分子激素、半抗原测定,酶免技术的分类,2、酶免技术特点,抗原抗体反应的特异性,+,酶高效催化反应的专一性,主要试剂: 酶标记的抗体或抗原 酶标物特点： 免疫学活性 酶对底物的催化活性,3、酶免技术原理及特点,原理： 酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应 酶对底物的显色反应 对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析,特点： 灵敏度高、特异性强、准确性好 酶标记试剂能够较长时间保持稳定 操作简便、对环境没有污染。 易与其它技术偶联 衍生出适用范围更广的新方法。,二、酶联免疫吸附试验,1、基本原理,.,原理,包被,1,2,反应 加入待测抗体或 抗原和酶标抗原 或抗体,3,洗涤 使结合在固相上 的抗原抗体复合物 与未结合的分离,4,底物显色 定性或定量的分析,三个必要试剂,固相的抗原或抗体,酶标记物（酶结合物）,酶反应的底物,.,双抗体夹心法（测抗原） 方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色 应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定 HBsAg、HBeAg、甲胎蛋白、HCG等,.,2、方法类型及反应原理,方法类型及反应原理,双位点一步法（测抗原） 方法：用单克隆抗体做成固相抗体和酶标抗体，待测抗原酶标抗原同时加入，加底物显色 应用：与双抗体夹心法相似，提高了特异性、灵敏度，需注意“钩状效应”,竞争法（测抗原） 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）,方法类型及反应原理,.,双抗原夹心法（测抗体） 原理：类似双抗体夹心法 操作步骤：类似 应用：乙型肝炎表面抗体,方法类型及反应原理,方法类型及反应原理,间接法（测抗体） 方法用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。 优点一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体 应用常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定,方法类型及反应原理,竞争法（测抗体） 原理：类似检测抗原的竞争法 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测,方法类型及反应原理,捕获法（测抗体） 应用：病原体急性感染诊断中的IgM型抗体 甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体,四、ELISA法检测注意事项,1、标本,避免溶血、 高脂血、 纤维蛋白凝块 尽量新鲜，避免细菌污染 一般5天内检测的血清可4保存，否则低温保存。,2、 试 剂 .试剂盒保存于2-8 .使用前应先将检测试剂 盒放置室温平衡15-30 分钟，保证酶等液体的初始反应温度及 活性剂的溶解。 .观察外包装和内组份有无漏液。,3、加 样 A. 加样不可太快； B. 要避免加在孔壁上部； C. 不可溅出； D. 避免产生气泡； E. 尽可能使用同一加样器，装紧枪 头，加样后充分混匀。 加样器定期校准！,温育温度的选择,足够的反应时间,“边缘效应”的排除,4、温 育,5、洗 板 按说明书洗板次数 防止洗板机堵孔 有适当的侵泡时间 每孔加入洗液350ul 不溢孔，残留5ul 洗板后拍干，封板纸 不能重复使用,6、显 色 检查底物溶液的有效性； 试剂显色时先加A液， 后加B液，二者不要颠倒。 前后加入的间隔时间 不超过10分钟，不漏加。 A、B液应避免接触污染物。 不同厂家、批次酶显色液 不得混用,7、终止和读数 肉眼判断不准确，影响结果 酶标仪的波长选择的问题。 加完终止液后30分钟内读取数据。 保证酶标板的底部是清洁干燥的。 酶标仪临界值计算公式的设定,8、结果判读,灰区又称灰色带反应。就是把OD值在Cut off值正负20%这个范围内的标本称为灰区标本。这个范围称为灰区。,.灰区是客观存在的，没有不存在灰区 的试剂，我们只是尽量减少灰区的出现比例。 .减少灰区最有效的方法就是尽量将板洗涤干净。,不同试剂盒，CUTOFF值计算方法不同,例：,五、ELISA法检测常见问题及解决方法,ELISA实验常见问题及解决方法,类风湿因子：一般为IgM型，可与变性IgG Fc段非特异结合，因此可能与包被的IgG以及随后加入的酶标IgG结合而产生假阳性。 补体：包被抗体及随后加入的酶标抗体均能激活补体而与补体C1q位点结合而产生假阳性，也可降低检测物与固相结合而引起假阴性或测值偏低 异嗜性抗体：人血清中含有抗 齿类动物（羊、鼠等）Ig的抗体，即天然异嗜性抗体。与酶标二抗出现假阳性。 溶菌酶：可与等电点5的低等电点蛋白强结合，双抗体夹心法ELISA可假阳性。 溶血：Hb中的血红素集团有类似过氧化