IG分子.ppt

抗体分子,抗体生物体最奇妙的分子,无限的多样性（diversity) 功能与结构的双重性 可变区抗原结合 恒定区生物学效应功能 分泌型和膜型表达,与抗体有关的诺贝尔奖获得者,本节课主要内容,一、抗体分子的基因结构和重组 二、细胞工程抗体和基因工程抗体 三、治疗性单抗研制进展,一、抗体分子的基因结构和重组,抗体分子结构,抗体分子片段,抗体基因基本结构,链的基因结构及重组,链的基因结构,重链的基因结构：(a) 鼠 (b) 人,重链可变区的VDJ重组,可变区V(D)J重组机制,重组信号序列(recombination signal sequences, RSS),通过RSS形成茎襻状结构,12/23 base pair role (1+2 turn role),: V-12 23-J : V-23 12-J H: V-23 12-D-12 23-J,V(D)J重组的缺失机制(a) 和倒转机制(b),抗体多样性的来源,2. B细胞个体发生过程中, 重组时CDR3所形成的多样性(不依赖抗原）,接头处的多样性,VJ重组时接头处的变化,V(D)J重组时接头处的变化： P核苷酸和N区的形成,D基因形成的多样性,6种阅读框架 D-D融合 10% DIR基因 7% 估算: 1014,3. 体细胞突变: 成熟B细胞经抗原刺激后产生,局限于V区的高频率随机突变 亲和力成熟,受体编辑(receptor editing)和免疫耐受,Ig可变区的再次重组,再次重组,自身抗原结合诱发再次重组受体编辑 克隆选择机制受体选择机制,重链恒定区的结构和重组,类别转换(class switching),S-S 重 组,膜表达和可溶性表达,二、细胞工程抗体和基因工程抗体,第一代：多克隆抗血清 第二代：细胞工程抗体 第三代：基因工程抗体,抗体技术的发展经历了三个阶段,细胞工程抗体杂交瘤-单克隆抗体,基因工程抗体,通过基因重组改良抗体性能 通过噬菌体抗体库技术研制新的抗体,小分子抗体,鼠单抗人源化,基因工程改造的抗体,小分子抗体,抗体融合蛋白,抗原结合部位与生物活性蛋白结合 免疫导向 免疫桥连 嵌合受体 含Fc段的抗体融合蛋白免疫黏附素 Fc的作用：检测、纯化、 延长血清中半寿期 生物学效应功能,鼠单抗人源化,恒定区人源化人-鼠嵌合抗体 可变区人源化人改型抗体 用抗体库技术进行人源化,鼠单抗人源化,抗原表位导向选择,抗体库技术,抗体库在原核系统功能性表达多样性抗体基因(repertoire) 通过多种选择手段筛选出特定性能的抗体基因,基因工程方法研制新的单抗,抗体库技术产生的三项技术基础, RT-PCR：能够克隆全套抗体可变区基因 抗体基因片段在大肠杆菌的功能性表达 噬菌体展示技术（phage display),噬菌体抗体图示,抗体库的构建,抗体库的富集筛选,抗体库技术的应用, 人源抗体的制备 抗体性能的改良 不经免疫制备抗体,用噬菌体抗体库技术制备人源抗体, 鼠单抗人源化抗原表位导向选择 （epitope guided selection） 从免疫个体构建噬菌体抗体库进行筛选 从总抗体库筛选（不经免疫制备抗体）,利用抗体库技术改良抗体性能,筛选具备特定功能或功能得到改善的未知序列 改善抗体的特异性 提高抗体的表达量 改善ScFv接头的性能 提高亲和力,亲和力成熟,低亲和力抗体,构建突变抗体库,错配PCR in vivo 突变 链更替 CDR随机化 有限性突变,动力学筛选,磁珠法液相筛选,游离抗原捕捉法,获得高亲和力变种,不经免疫制备抗体体外模拟体内的抗体生成,抗体生成三要素, 多样性B细胞群体（repertiore）, 克隆选择, 亲和力成熟,总抗体库(master library)的构建, 抗体库容量, 多次构建累积, 组合感染法,目前报道最大库容在109-1010,最大库容 6.5X1010,组合感染法构建抗体库, 构建策略, 天然抗体库, 半合成抗体库, 全合成抗体库,半合成抗体库,体外模拟V-DJ重排,合成随机化CDR3,全合成抗体库,7个VH, 7个VL, 共49个子库,CDR盒式结构,几种技术路线评价, 天然库：100%有功能、CDR3-H长度广泛、 CDR3序列结构合理, 半合成库：避免体内偏向性、可操作性,缺点：体内多样性具有偏向性,缺点：有无效克隆、CDR3-H长度受限, 全合成库：尚无证实报道，据初步资料 效果颇佳，构建难度大,治疗性单抗的研究进展,1. 杂交瘤-单克隆抗体技术诞生 2. 抗独特型治疗淋巴瘤成功 3. OKT3被批准上市 4. 单抗用于肿瘤治疗效果不佳 5. 抗内毒素单抗试用于败血性休克失败 6. 抗17-1A和ReoPro上市 7. FDA批准6个单抗上市,治疗性抗体发展历程和事件,抗体名称 抗体种类 靶向抗原 适应症 批准日期 OKT3 鼠单抗 CD3 移植排斥 1986 Panorex 鼠单抗 17-1A 大肠癌 1995（德国） ReoPro 人-鼠嵌合Fab 血小板受体 冠心病 1994 ba Rituxan 人-鼠嵌合抗体 CD20 淋巴瘤 1997 Simulect 人-鼠嵌合抗体 CD25 移植排斥 1998 Remicade 人-鼠嵌合抗体 TNF- 炎症性肠病、 1998、 类风湿关节炎 1999 Zanapax 人源化抗体 CD25 移植排斥 1997 Herceptin 人源化抗体 HER-2 乳腺癌 1998 Synagis 人源化抗体 RSV F蛋白 RSV感染 1998 Mylotarg 人源化抗体 - CD33 淋巴瘤 2000 化疗药物交连物 Campath 人源化抗体 CD52 淋巴瘤 2001,已批准上市的治疗性单抗,治疗性单抗销售概况,国外有关抗体开发的评述, 正在临床试用的治疗性单抗超过上百种, 1998-2000年20%研制的生物药品为单抗, 10年后市场上的单抗将从现在的 11个 100个以上，预计销售额为$500亿, 预计到2008年7个主要市场用于肿瘤的治疗性单抗的销售额达44亿美圆,进入临床治疗性单抗情况分析,治疗肿瘤： 32% 治疗免疫系统相关疾病： 37% 器官移植： 11% 感染： 8% 心血管： 4% 其它： 6%,所治疗的疾病,所针对的抗原,/抗原数 /应用数 细胞膜分子： CD系列： 35% 42% 膜受体及粘附分子：17% 15% 肿瘤相关抗原： 10% 5% 细胞因子类： 21% 26% 独特型： 6% 5% 病毒： 10% 7%,人源化和人源抗体制备技术的成熟是治疗性单抗进展的关键,在目前进入临床的单抗中： 60%为人源化鼠单抗 20%为人源单抗 20%为鼠单抗（其中70%用于肿瘤）,人源抗体研制的基本路线, 人血清来源 人杂交瘤单克隆抗体 鼠单抗人源化 噬菌体抗体库 转基因小鼠,转基因小鼠制备人源抗体,灭活小鼠胚系Ig基因 基因敲除JH、JK和CK基因段,将人胚系Ig基因转移到小鼠染色体 微基因位点胚胎细胞注射 人工染色体技术 微胞介导的染色体转移,微胞介导的染色体转移,治疗性抗体的发展趋势,人源抗体制备技术已经成熟，今后将进入以人源抗体为主的时代,基因工程抗体逐渐从研究走向临床,靶向抗原的研究和选择已逐渐成为研制治疗性单抗的关键,Reuben S等人用DT40细胞系（由鸡的B淋巴细胞瘤中获取）研究，结果表明DT40细胞中AID的缺陷将导致基因转换的缺陷，检测V重排后的基因序列未发现任何一个单一的基因转换，而出现的仅有的三个单核苷酸的置换（频率为105）可能为PCR错配所致。而其中机制可能是因为对DNA的损害，造成DNA双链的断裂所致7。在上面提到的AID-BER途径中，当AP核酸内切酶切开磷酸二酯键，而这个切口未被BER及时修复，将在重排后的V区发生核苷酸置换即将假基因置换进入，有时是插入或删除某些核苷酸，则将导致基因转换。（图1）此种基因转换机制在鸡和兔是B细胞中Ig多样性产生的主要机制，但在人和小鼠中还未得到论证4。而关于基因转换的具体机制也还未清