双酶切及连接.ppt

5组：李东 老师：陈思,双酶切及连接,目录,原理 类型 命名法 实验 注意事项 连接 常见问题及对策,DNA的限制性酶切实验原理,核酸限制性内切酶是一类能识别双链中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统， 用于抗击外来的侵袭。 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产生的片段端为，端为。,根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为、型三大类。,限制性内切酶的类型,限制性内切酶的类型,第一类（I型）限制性内切酶：能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。,第二类（III型）限制性内切酶：也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。,限制性内切酶的类型,第三类（型）限制性内切酶：就是通常指的限制性内切酶. 它们能识别双链的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的片段； 型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为个碱基对的反转重复顺序； 型内切酶切割双链产生种不同的切口端突出；端突出和平末端。 正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能在体外有目的地对遗传物质进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。,限制性内切酶的类型,粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。 如EcoRI的识别顺序为： 5 G|AATTC 3 3 CTTAA|G 5 在双链上交错切割的位置切割后生成 5G AATTC3 3CTTAA G5 各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。,II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5 GAT|ATC 3 3 CTA|TAG 5 切割后形成 5 GAT ATC 3 3 CTA TAG 5 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。,平头末端：,用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜体字。 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，如Hind, Hind，Hind等。,限制性核酸内切酶的命名法,实验材料及仪器,高速离心机，电炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，量筒，移液枪，冰盒，枪头，Ep管，手套，记号笔，TAE电泳缓冲液(10)，琼脂糖，溴化乙锭(EB)，质粒DNA,双酶切,按如下体系加入到0.5ml离心管中,加体系离心 37 水浴1h 跑电泳,结果,结果与分析,质粒的双酶切没有出现结果但marker出了条带说明胶没有问题，而PCR的酶切产物出现了较好的实验结果。,内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端； 内切酶的用量：根据内切酶单位和用量而定。 同时内切酶体积不能超过反应体系，因内切酶中含甘油，体系中甘油超过会抑制内切酶活力； 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。,五、注意事项限制性内切酶酶切,连接反应,DNA 分子的体外连接（重组）是指外源 DNA 片段和载体 DNA 分子在体外通过 DNA 连接酶共价连接。 DNA酶切片段的联接是两DNA片段相邻的 5磷酸和3羟基间可由联接酶催化形成磷酸二酯键，即能完成联接反应。,连接体系,内切酶失活 DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子 条件不适（试剂、温度） DNA酶切位点上的碱基被甲基化 DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I） DNA位点上存在其它修饰 DNA不存在该酶识别顺序,标准底物检测酶活性 将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA 检查反应系统是否最佳 换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株 换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+ dam+菌株中扩增 将DNA底物与DAN混匀进行切割验证 换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证,六、限制性内切酶酶切常见问题分析,问题一：DNA完全没有被内切酶切割,原 因,对 策,内切酶活性下降 内切酶稀释不正确 DNA不纯，反应条件不佳 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰 部分DNA溶液粘在管壁上 内切酶溶液粘度大，取样不准 酶切后DNA粘末端退火 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性 过度稀释使酶活性降低 反应条件不适 识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序,用5-10倍量过量消化 用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶 同上 同上 反应前离心数秒 将内切酶稀释，增大取样体积 电泳前将样品置65保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷 使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡 适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏