结核病实验室生物安全与菌株运输

结核病实验室生物安全及菌株运输,内 容,一、结核病实验室生物安全 二、结核菌株或样本运输 三、风险评估,一、结核病实验室生物安全,结核杆菌的生物学性状,1、结核杆菌为细长略带弯曲的杆菌，约1-40.3-0.6m， 常聚集成团，牛型比人型略粗短； 2、分枝杆菌属的细菌细胞壁脂质含量较高，约占干重的 60%，特别是其中的大量分枝菌酸可影响染料的穿入； 3、一般用萋-尼（Ziehl Neelsen）抗酸性染色法，以5%石炭酸复红加温染色后可以染上，但着色后不易被盐酸酒精脱色；,结核杆菌的生物学性状,4、若再加用美蓝复染，则分枝杆菌呈红色，而其它细菌及 背景中的物质为蓝色； 5、专性需氧，最适温度为37，低于30或高于42均不 生长；营养要求较高，生长缓慢，初次分离需要营养丰 富的培养基。常用的有Lowenstein-Jensen培养基，内 含蛋黄、甘油、无机盐和孔雀绿等。 6、细胞壁的脂质含量较高，影响营养物质吸收，故生长缓 慢，在一般培养基中每分裂一代需要10多个小时，在人 体内需24-36小时；,结核杆菌的生物学性状,7、一般10-30天可见菌落生长，菌落呈颗粒、结节或花菜 状，乳白色或米黄色，不透明； 8、结核杆菌细胞壁中含有大量脂质，可防止菌体水分的丢 失，故对干燥的抵抗力特别强，沾附在尘埃上保持传染 性8-10天，在干燥痰内可存活6-8个月； 9、结核杆菌对湿热敏感，在液体中加热62-63后15分钟 或煮沸即被杀死；,结核杆菌的生物学性状,10、结核杆菌对紫外线敏感，直接日光照射数小时可被杀 死，可用于结核患者衣服、书籍等的消毒； 11、结核杆菌的抵抗力与环境中有机物的存在有密切关系，如痰液可增强结核杆菌的抵抗力，因大多数消毒剂可使痰中的蛋白质凝固，包在细菌周围，使细菌不易被杀死； 12、5%的石炭酸在无痰时30分钟可杀死结核杆菌，有痰时需要24小时；5%的来苏儿无痰时5分钟杀死结核杆菌，有痰时需要1-2小时；,结核杆菌的生物学性状,13、结核杆菌对酸（3%HCL）或碱（4%NaOH）有抵抗力，15分钟不受影响，可在分离培养时用于处理有杂菌污染的标本和消化标本中的粘稠物质； 14、结核杆菌对1：75000结晶紫或1：13000孔雀绿有抵抗力，加在培养基中可抑制杂菌生长； 15、结核杆菌对链霉素、异烟肼、利福平、环丝氨酸、乙胺丁醇、卡拉霉素、对氨水杨酸等敏感，但长期用药容易出现耐药性，而吡嗪酰胺的耐药性5%。,实验室安全操作原则,1、实验室应按等级要求完善实验设施，如生物安全柜的抽 风排风功能、紫外灯消毒、生物安全柜内的除菌滤膜定 期更换等； 2、普通实验室应注意气流方向，实验过程中尽量避免强气 流变化而产生气溶胶（如：人员走动等 ）； 3、易产生气溶胶或出现溅出的操作,如涂片、离心或其它操 作，应在BSL-2实验室的级生物安全柜中进行，并使用个体防护设备；,4、尽可能减少使用注射器针头，实验中使用注射器时，用过 的针头切勿再重新入套或拔开注射器与针头，应直接放入 锐气收集器，以免划破皮肤造成接种感染； 5、试验结束后，操作过程中所有可能与生物危险物接触或被 污染的实验器械或物品，能够高压的必须进行高压消毒； 6、实验中发生意外污染情况，应立即报告。,实验室安全操作原则,实验室安全操作-意外事故处理,1、实验过程中，如标本或含标本的前消化处理液被打翻， 污染操作台或地面，应以吸满75乙醇溶液的卫生纸覆 盖污染区，15分钟后卫生纸方可移去； 2、实验过程中，如污染物溅落到身体表面，或有割伤、刺 伤、烧伤、烫伤等情况发生，应立即停止实验并进行紧 急处理；更换被污染的工作服，皮肤表面用消毒液清 洗，伤口以碘酒及酒精消毒，眼睛用无菌生理盐水冲洗； 3、被污染的器械等立即浸泡于含氯消毒剂或75乙醇等溶 液中，实验完成后再进行高压消毒处理； 4、如果发生气溶胶污染或大面积污染，应立即停止实验并 关闭实验室，对实验区域和实验室进行紫外灯照射消毒2 小时以上；对污染区域进行空气熏蒸消毒。,实验室安全操作-绝对禁止的处理方法,1、有可能造成污染面积扩大，如使用75乙醇或甲酚皂液 擦洗被污染的区域； 2、直接用火焰对未经任何处理的污染地面、操作台、器械 进行烧灼处理； 3、使用消毒效果未经证实的消毒剂进行消毒； 4、使用低浓度的消毒剂和紫外灯进行短时间、长距离照射 消毒。,实验室消毒与灭菌,1、物理消毒：紫外线、高压灭菌 2、化学消毒：乙醇、过氧乙酸、苯酚、含氯消毒剂 3、注意事项,物理消毒紫外线,1、紫外线对结核杆菌有一定的杀灭作用，用辐射 强度在 100w/cm2以上的30W紫外线灯、相对湿度50%70%的 条件下，照射40min以上，对空气中结核杆菌的杀灭效 果可达99.9%以上； 2、在液层厚度3mm含菌107108cfu/ml的结核杆菌的菌悬 液，用10W紫外线灯在距离0.5m处持续照射3分钟，在 距离1m处持续照射10分钟后，菌悬液经培养无活菌生 长； 3、紫外线穿透力弱，通常用于空气和物体表面消毒，对空 气中细菌的杀灭更具优势，适合随时性空气消毒。,物理消毒高压灭菌,1、高压灭菌是对实验材料灭菌的最有效和最可靠 的方法； 2、通常下列组合可以确保正确装载的高压灭菌器 的灭菌效果： 121、15min/ 115、25min 推荐121、30min。,化学消毒乙醇,1、结核杆菌（纯培养物）直接接触70%-75%乙醇5-30 分钟可被杀死，可用于皮肤消毒； 2、但由于乙醇能凝固蛋白，使痰表面形成一层把菌 体包裹起来的膜，短时间内不能杀死细菌，通常 乙醇不用于痰标本的消毒。,化学消毒过氧乙酸,1、过氧乙酸气溶胶渗透性强、易蒸发，作用快 速，分解后不留有毒物质，适合于空气消毒； 2、用5g/L过氧乙酸水溶液经气溶胶喷雾器喷雾消 毒，喷雾量为2010ml/m3，密闭60min以上。,化学消毒苯酚,1、主要通过破坏菌细胞膜而致细胞质内容物漏 出，使菌体蛋白质变性、凝固，抑制菌体脱氢 酶和氧化酶等酶系统杀死结核杆菌； 2、2%苯酚5分钟、5%苯酚1分钟能杀死结核杆菌培 养物； 3、5%苯酚与痰液等量混合，24小时才能杀死结核 杆菌。,化学消毒含氯消毒剂,含氯消毒剂能使菌体的酶失活，还能与蛋白质 的氨基结合，使菌体蛋白氯化，代谢功能障碍，细 菌死亡。但对在蛋白质混合液中的结核杆菌几乎无 消毒效果。,化学消毒其它,1、结核杆菌较一般细菌对酸、碱抵抗力更强，可 在临床或动物标本中加入4%NaOH，3%HCL和6%H2SO4，消化蛋白质及杀灭杂菌，以分离出结核杆菌； 2、结核杆菌对染料，如113000孔雀绿和175000结晶紫有抵抗力，通常在培养基内 加入一定量的孔雀绿或结晶紫抑制其他杂菌 生长。,注意事项,1、实验室含有生物危险物的临床标本及被污染的一次性用 品，实验完成后，应经高压消毒后方可丢弃或焚烧； 2、可重复使用的试验用品及器械，高压灭菌后再清洗使用； 3、试验用的试管、吸管、注射器，须装在加盖的容器内，经 高压消毒后拿出实验室； 4、培养物或实验室垃圾，在丢弃前必须经过高压灭菌处理； 5、实验室内未经消毒的污水，禁止直接排入公共排水系统， 更不允许混入居民生活垃圾。,生物安全柜的使用,1、正确安装，确保安全柜与外部排风系统压力平衡，保证安全柜处于正常工作状态，定期维护和检测，确保安全性； 2、在开始工作前应考虑实验中的操作步骤和所需设备，充分做好准备工作； 3、尽量减少房间内人员走动，保证正常气流； 4、准备好消毒剂和处理遗洒事件的物品； 5、前窗开至适当高度，打开安全柜的灯和风机；,生物安全柜的使用,6、将本次实验所需物品放入生物安全柜内，并按照清洁物和污染物分别排列； 7、避免物品挡住隔栅； 8、将手缓慢放入生物安全柜，并等待2-3min，操作 时应在隔栅内侧靠近隔栅处操作； 9、避免使用干扰安全柜内层流的实验手段（如离心 和使用明火等）；,生物安全柜的使用,10、与污染物接触过的物品从生物安全柜中取出之前 必须经表面去污处理； 11、所有的托盘或容器从安全柜中取出前必须盖上； 12、用75%酒精清洁安全柜所有内壁，清洁时安全柜 风机必须处于风机工作状态； 13、工作结束后，安全柜继续开机3-5min； 14、关闭前窗、灯、风机，打开紫外灯。,干净的物品,理想的工作台摆放原则（清洁-污染区） 在工作台面上的实验操作应该按照从清洁区到污染区的方向进行,被污染的区域,垃圾袋,废弃物托盘,生物安全柜的使用,二、菌株运输,法律依据,1、病原微生物实验室生物安全管理条例（国务院令第424号 2004.11.12） 2、可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输 管理规定（卫生部令第45 号 2005.12.28） 3、人间传染的病原微生物名录（卫生部 2006.1.11） 4、中国民用航空危险品运输管理规定（CCAR276） 5、危险物品航空安全运输技术细则（国际民航组织）,相关定义,1、病原微生物:是指能够使人或者动物致病的微生物。 2、实验活动:是指实验室从事与病原微生物菌（毒） 种、样本有关的研究、教学、检测、诊断等活动。 3、可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或 样本：是指在人间传染的病原微生物名录中 规定的第一类、第二类病原微生物菌（毒）种或 样本。,结核杆菌分类人间传染的病原微生物名录 ,第二类：是指能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在 人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物。 样本检测：包括样本的病原菌分离纯化、涂片、显微观察、培养、药物敏 感性实验、生化鉴定、免疫学实验、PCR 核酸提取、等初步检 测活动。,县级将菌株或样本运输至州级,一、申请材料（原件一份，复印件三份）： 1、可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运 输申请表.doc；（县级） 2、容器或包装材料的批准文号、合格证书（复印件）或者 高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输容器或包装 材料承诺书;（县级） 3、申请方（县级）、接收方（州级）双方法人资格证明材 料（复印件）； 4、接收菌株或样本的单位(州级)同意接收的证明文件（州 级自己拟定文件并加盖单位公章）； 备注：接收单位（州级）具备从事高致病性病原微生物实 验活动资格的证明即要求接收单位（州级） 在当地卫生局进行病原微生物实验活动备案。,县级将菌株或样本运输至州级,二、运输有关规定： 1、在固定的申请单位（县级）和接收单位（州级）之间多次 运输相同品种菌株种或样本的，可以申请多次运输。多次 运输的有效期为6个月；期满后需要继续运输的，应当重新 提出申请； 2、应当通过陆路运输；没有陆路通道，必须经水路运输的， 可以通过水路运输；紧急情况下或者需要将菌株或者样本 运往国外的，可以通过民用航空运输； 3、有关单位或者个人不得通过公共电（汽）车和城市铁路运 输菌株或样本。,县级将菌株或样本运输至州级,二、运输有关规定： 4、运输菌株或者样本，应当由不少于人的专人护 送，并采取相应的防护措施； 5、承运单位应当与护送人共同采取措施，确保所运 输的菌株或样本的安全，严防发生被盗、被抢、 丢失、泄漏事件。,县级将菌株或样本运输至州级,三、被盗、被抢、丢失、泄漏事的处理：,承运单位护送人 保藏机构,承运单位的主管部门护送人所在单位 保藏机构的主管部门,县级卫生主管部门或者兽医主管部门,公安机关,县人民政府,市级卫生主管部门或者兽医主管部门,省级卫生主管部门或者兽医主管部门,国务院卫生主管部门或者兽医主管部门,市人民政府,省、市、自治区人民政府,任何单位和个人,小时,小时,小时,小时,小时,小时,1小时,菌株或样本运输包装要求,菌株或样本运输包装要求,菌株或样本运输包装主容器,菌株或样本运输包装次级容器,菌株或样本运输包装外包装,菌株或样本运输流程,三、风险评估,结核杆菌实验室实验活动,不同实验操作的实验室生物安全级别要求： 1、BSL-3实验室：根据名录的规定，在实验操 作涉及结核杆菌的大量培养（制备）、结核杆菌离心、冻干等易产生气溶胶的实验操作。 2、BSL-2实验室：临床样本的结核杆菌分离培养、 药物敏感性实验、生化鉴定、免疫学实验、PCR核酸提取、涂片、显微观察等初步检测活动。 3、BSL-1实验室:对经有效方法灭活后不含结核杆菌 活菌材料的分子生物学、免疫学等实验。,实验活动中可能造成不良后果的 因素与预防措施,1、实验样本的接收与开启 临床含结核菌样本在运输过程中可能会因容器盖子脱落或破碎使一些菌体产生气溶胶，扩散进入空气而造成污染。 预防措施 应采取防护措施，要求接收和打开样品要在级生物安全柜内打开，小心操作，避免产生气溶胶，操作人员要佩戴N95口罩，并准备好消毒剂。,实验活动中可能造成不良后果的 因素与预防措施,2、结核杆菌培养（固体、液体培养） 在进行结核杆菌接种培养过程中，样本开封、转移、吸管吹吸、漩涡振荡混匀、离心等步骤均可产生气溶胶，在样本转移过程中培养物混合液的溅出、泼洒和容器的破碎等也可造成严重污染。 预防措施 （1）在级生物安全柜工作台面应当放置一块垫布，避免 感染性物质的滴溅，使用后将其高压灭菌，操作过程 中最好使用无菌的一次性吸管； （2）涡旋振荡、离心过程中应拧紧样本容器盖子，待气溶 胶沉淀后在级生物安全柜打开盖子； （3）样本容器尽可能使用塑料制品，足够坚固，盖好盖子 后应无泄漏； （4）样本接种后将其固定在架子上，尽可能保持直立。,实验活动中可能造成不良后果的 因素与预防措施,3、结核杆菌药敏试验 在药敏试验中菌悬液制备时，需对培养物进行研磨，在使用玻璃研磨器时容器内会产生压力，含有感染性物质的气溶胶就可能逸出，玻璃容器可能破碎而释放感染性物质并伤害操作者。 预防措施 应采取防护措施，使用玻璃研磨器时应戴手套、N95口罩，操作和打开研磨器时应当在级生物安全柜内进行。,实验活动中可能造成不良后果的 因素与预防措施,4、培养物与实验废弃物销毁 在待销毁培养物转移过程中培养物混合液溅出、泼洒和容器的破碎等可造成严重污染；实验室内实验废弃物容器外表可能污染病原微生物，未经消毒转移造成污染；用于销毁的培养物与实验废弃物，置入高压灭菌器，如装得过满或过于密闭，可能造成灭菌不彻底，将未灭活的培养物与实验废弃物送出室外，对人与环境造成极大威胁。 预防措施 （1）传代菌种或培养物销毁应有销毁程序及相应原始记录，所有 菌种或培养物灭活或销毁时应均有2人以上共同执行，销毁记 录应包括销毁方式、销毁物品明细、灭菌温度与