第四讲常用分子克隆工具酶简介.ppt

常用工具酶简介,第一节 DNA连接酶(DNA ligase),1 DNA Ligase 1.1 概念 1.2 分类 根据连接反应时所需能量辅助因子的不同： 依赖ATP的DNA ligase 依赖NAD+的DNA ligase,按照来源分： T4噬菌体DNA ligase 大肠杆菌DNA ligase 热稳定DNA ligase,2 DNA ligase简介 2.1 T4 DNA ligase 连接类型： DNA-DNA DNA-RNA RNA-RNA dsDNA的黏性末端和平末端,2.2 大肠杆菌 DNA ligase dsDNA的黏性末端和平末端,3 DNA ligase 催化连接反应的特点 3.1 需要3-OH 和5-P 3.2 需要ATP或NAD+和Mg2+为辅助因子和激活因子 3.3 被连接的是dsDNA 3.4 只能封闭缺口,4 影响DNA ligase 连接反应的因素 4.1 温度 黏性末端 4-15 平末端 10-20 4.2 连接酶浓度 平末端 1-2个单位 黏性末端 0.1个单位,4.3 ATP浓度 4.4 DNA片段末端,第二节 DNA 聚合酶和反转录酶,DNA 聚合酶：在引物和模板的存在下，把脱氧核糖单核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3-OH 末端，催化核苷酸的聚合作用。,1 DNA polymerase分类,依赖于DNA的DNA聚合酶: Ecoli DNA polymerase I klenow片段 T4 phage DNA ploymerase T7 phage DNA ploymerase 耐热DNA聚合酶(Taq 酶) 依赖于RNA的DNA聚合酶: 反转录酶(reverse transcriptase),1.1 Ecoli DNA polymerase I 分类： DNA pol I DNA pol DNA pol ,DNA pol I特性： 5-3DNA聚合酶活性 3-5外切酶活性 5-3外切酶活性 （切口平移）,1.2 Klenow片段 大肠杆菌DNA聚合酶I的枯草杆菌蛋白酶水解产物。 活性：5 3聚合酶 3 5外切酶,用途： 3-末端补平 3-末端抹平 cDNA第二链合成 双脱氧系统测序,3-末端补齐 3-末端标记 5-ACGTTGCAAACTG-3 3-TGCAACGTTTGAC5 cDNA第二链合成 mRNA 3-UGCAACGUUUGAC5 c DNA 5-ACGTTGCAAACTG GAC,5,3,5,3,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,热变性,随机引物 退火,-32PdNTP Klenow 酶, 5,5,5-,- 5, ,1.3 T4 DNA polymerase 特点： 53聚合酶活性 35外切酶活性,用途： 补平反应 末端标记 抹平反应,1.4 Taq DNA polymerase 特点： 分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度75-80 。 5-3聚合酶活性 5-3外切酶活性 用途： 主要用于DNA的体外扩增,Taq Pol 和PCR,1.5 反转录酶(reverse transcripase) 用途： cDNA第一链的合成 补平反应 用于DNA测序,第三节 DNA修饰酶,1.1 末端转移酶（TdT） 反应特点 在酶的催化下将dNTP加到DNA分子的3OH末端，催化作用不需要模板。 用途 3-加尾，便于两DNA分子重组 3-末端标记,1.2 T4 多聚核苷酸激酶 催化反应： 正向反应 催化5-OH末端的磷酸化 交换反应,1.2 T4 多聚核苷酸激酶 用途： 1) DNA或RNA的5末端标记 2) 分子克隆过程中以获得5-磷酸基末端，便于连接酶反应,1.3 碱性磷酸酶 用途 1) 载体DNA的去磷酸化，防止自我连接，以增加重组频率 2) 5端 核酸末端标记,碱性磷酸酶与T4 多聚核苷酸激酶活性,第四节 外切核酸酶,1 外切核酸酶概念 2 分类 按照酶对底物二级结构的专一性，分为： 作用于单链的外切核酸酶 作用于双链的外切核酸酶,第五节 单链内切核酸酶,1.1 S1核酸酶 特点： ss-DNA; ss-RNA; 双螺旋变性区 用途 1) 基因突变-缺失，常与外切酶，如ExoIII、外切酶、Bal31连用 2) DNA定序分析 3) S1作图法 4) 基因结构分析 5) tRNA结构分析,S1核酸酶活性,1.2 Bal 31 核酸酶 对单链DNA具有特异的内切酶活性，可从3OH端降解DNA。对于L-DNA，它表现3-5的外切酶活性和5-3的外切酶活性，可又有控制地从3端和5端逐个水解除去单核苷酸，产生缩短了的DNA分子。,1.3 DNase I 用途 1) 切口移位，制备DNA探针 2) 制备RNA样品时除去DNA分子 3) 基因突变时产生切口,ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口,第六节 RNA酶,1.1 RNase,用途： 在DNA制备时用于降解RNA分子 去除DNA:RNA 或RNA:RNA中没有杂合的 RNA区域,1.2 RNase H,特异地降解DNA:RNA杂合链中的RNA部分，产生不同长度的具有3OH和5P端的寡核苷酸，它不能降解单链或双链的DNA（或RNA).,切平反应和补平反应,四种不同补平反应,5-GGATCC-3 BamHI 5-G GATCC-3 3-CCTAGG-5 3-CCTAG G-5 dNTP dGTP dGTP/dATP dGTP/dATP/dTTP 5-GGATC 5-GG 5-GGA 5-GGAT 3-CCTAG 3-CCTAG 3-CCTAG 3-CCTAG GATCC-3 GATCC-3 GATCC-3 GATCC-3 CTAGG-5