核酸的生物合成.ppt

核酸的生物合成,本章重点介绍遗传中心法则和DNA、RNA的生物合成，对基因工程作一般介绍。,返回,思考,DNA是绝大多数生物体遗传信息的载体，继1953年Watson & Crick提出DNA双螺旋结构模型后，1958年，Crick提出了“中心法则”(Central dogma)揭示了遗传信息的传递规律。,遗传信息传递的 中心法则,中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。,目 录,第四节 基因工程及分子生物学技术简介,第一节 DNA的生物合成,第二节 RNA的生物合成,第三节 核酸合成的抑制剂,第一节 DNA的生物合成,一、DNA的复制（DNA指导下的DNA合成）,三、DNA突变,四、 DNA的损伤与修复,二、逆转录作用（RNA指导下的DNA的合成）,一、DNA的半保留复制,1、概念和实验依据,2、原核生物DNA聚合反应有关的酶类 3、原核细胞DNA的复制的起始点和方式,5、DNA复制的忠实性 6、真核细胞DNA的复制,4、原核细胞DNA的复制过程（半不连续复制）,DNA的半保留复制的概念,DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。,原核生物DNA聚合反应有关的酶类,（1）DNA聚合酶(DNA polymetases) （2）引物酶(peimase)和引发体(primosome) ：启动RNA引物链的合成。 (3） DNA连接酶（DNA ligase） （4）DNA解链酶(DNA helicase) (5）单链结合蛋白(single-strand binding protein,SSB)：结合在解开的DNA单链上，防止重新形成双螺旋。 (6）拓扑异构酶(topoisomerase):兼具内切酶和连接酶活力，能迅速将DNA超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。,复制的忠实性,DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制109-1010碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点:,a、DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循 碱基配对原则）,b、DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3-5 外切酶切除）,c、起始时以RNA作为引物,DNA的半保留复制实验依据,1958年Meselson & stahl用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验,证明了DNA是采取半保留的方式进行复制.,15N DNA,14N- 15N DNA,14N DNA,14N- 15N DNA,连接酶连接切口,Mg2+,连接酶,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,P,OH,T,G,G,A,T,C,G,P,T,T,P,P,P,A,A,C,C,T,G,A,P,A,C,P,P,P,T,G,G,P,缺口,3,3,5,5,5,5,3,3,模板链,模板链,大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列,DNA复制的方式,复制叉,复制叉,未复制DNA,单向复制,双向复制,原核细胞DNA的半不连续复制复制过程,复制叉的移动方向,3,5,3,5,DNA聚合酶全酶,DNA聚合酶二聚体,DNA聚合酶催化的链延长反应,子链,大肠杆菌三种DNA聚合酶比较,DNA 聚合酶,分子量 每个细胞的分子统计数 5-3 聚合酶作用 3-5 核酸外切酶作用 5-3 核酸外切酶作用 转化率,DNA 聚合酶,DNA聚合酶 （复合物）,109，000 400 + + + 1,120，000 100 + + - 0 .05,400，000 10-20 + + + 50,比较项目,DNA聚合酶的3- 5 外切酶水解位点,复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型,DNA聚合酶的校对功能,DNA聚合酶的校对功能,聚合酶,错配硷基,复制方向,正 确核苷酸,5,5,5,3,3,3,切除错配核苷酸,真核细胞DNA复制的特点, 多个起点复制, 端粒（telemere）复制,端粒酶（telomerase）,DNA复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶是一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于RNA模板的DNA片段的合成，使复制以后的线形DNA分子的末端保持不变。,初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。,端粒酶,端粒合成的一种模型,整合和杂交,真核和原核DNA细胞复制比较,二、逆 转 录 作 用,1、概念,2、逆转录酶,3、病毒逆转录过程,4、逆转录的生物学意义,扩充了中心法则 有助于对病毒致癌机制的了解 与真核细胞分裂和胚胎发育有关 逆转录酶是分子生物学重要工具酶,三种功能,逆转录过程中cDNA的合成,逆逆转录病毒的生活周期 生活周期,RNA,衣壳,被膜,逆转录酶,转录,转译,整合入宿主细胞染色体DNA,进入细胞,丢失被膜,丢失衣壳,逆转录,RNA,RNA,cDNA,衣壳蛋白,被膜蛋白,逆转录酶,三、DNA的突变,DNA分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致DNA的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为DNA的突变。它包括由于DNA损伤和错配得不到修复而引起的突变，以及由于不同DNA分子之间的交换而引起的遗传重组。,二、诱变剂的作用 碱基类似物(base analog) 碱基修饰剂(base modifier) 嵌入染料(intercalation dye) 紫外线(ultraviolet)和电离辐射(ionizing radiation),一、突变的类型 碱基对的置换(substitution) 移码突变(framesshift mutation),DNA突变的类型,野生型基因,碱基对的置换(substitution),移码突变 (framesshift mutation),四、DNA的损伤与修复,某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都有引起生物突变和致死的作用，其机理是作用于DNA，造成DNA结构和功能的破坏，称为DNA的损伤. DNA的修复主要有以下类型:,暗修复,（4）诱导修复（SOS修复）,（1）光裂合酶修复活,（2）切除修复,（3）重组修复,DNA紫外线损伤的光裂合酶修复,1、形成嘧啶二聚体,2、光复合酶结合于 损伤部位,3、酶被可见光激活,4、修复后酶被释放,DNA的损伤和切除修复,碱基丢失,碱基缺陷或错配,结构缺陷,切开,核酸内切酶,核酸外切酶,切除,DNA聚合酶,DNA连接酶,AP核酸内切酶,核酸外切酶,切开,切除,修复,连接,糖苷酶,插入酶,碱基取代,DNA的重组修复,胸腺嘧啶二聚体,复制,核酸酶及重组蛋白,修复复制,DNA聚合酶,DNA连接酶,重组,SOS反应的机制,靶基因表达,lexA靶基因表达 但产物被分解,recA大量表达,RecA促使分解LexA,未诱导的细胞,诱导的细胞,靶基因,lexA基因被LexA 蛋白质部分阻遏,recA基因被LexA 蛋白质部分阻遏,（40个不同的位点被阻遏）,LexA(阻遏物),RecA(辅蛋白酶),第二节 RNA的生物合成,一、DNA指导下RNA的合成（转录）,二、 RNA指导下RNA的合成(RNA的复制),三、RNA和DNA合成比较,一、DNA指导下RNA的合成（转录）,1、概念及DNA的有义链和反义链,2、RNA聚合酶及催化反应,3、RNA合成过程,4、RNA转录后的加工 5、真核生物的RNA合成,转录的概念和DNA的有义链和反义链,转录是在 DNA的指导下的RNA聚合酶的催化下，按照硷基配对的原则，以四种核苷酸为原料合成一条与模板DNA互补的RNA 的过程。RNA的转录从DNA模板的特定位点开始，并在一定的位点终止。此转录区域为一个转录单位。,启动子（promoter),终止子(terminator),模板链（templatte strand） 反意义链(antisense strand),有意义链(sense strand),非信息区,DNA,5,5,3,3,大肠杆菌RNA聚合酶的结构示意图,核心酶(2),起始因子,和模板DNA结合 起始和催化聚合反应 ？,全酶( ),RNA聚合酶催化的反应,A,C,G,A,C,G,U,U,模板DNA,5,3,新合成RNA,RNA合成过程,起始,双链DNA局部解开,磷酸二酯键形成,终止阶段,解链区到达基因终点,延长阶段,RNA,启动子（promoter),终止子(terminator),RNA链的延伸图解,原核生物中rRNA前体的加工,甲基化作用 专一核酸内切酶,30S前体,17S,tRNA,25S,专一核酸外切酶,16S rRNA,tRNA,23S rRNA,5S rRNA,专一核酸外切酶,tRNA前体分子的加工,a、切除tRNA前体两端多余的序列： 5端切除几到10个核苷酸。,b、末端添加：3-端添加CCA序列。,c、修饰：形成稀有碱基如DH2 。,RNAaseP,RNAaseF,RNAaseP,RNAaseF,RNAaseD,RNAaseD,ACC,表示核酸内切酶的作用,表示核苷酸转移酶的作用,表示核酸外切酶的作用,表示异构化酶的作用,真核细胞mRNA的加工,5 “帽子”,PolyA 3,顺反子(cistron ),AAAAAAA-OH, 5端接上一个“帽子”(CAP)结构 3端添加PolyA“尾巴”,由RNA末端核苷酸转移酶催化 剪接：剪去内含子(intron)，拼接外显子(extron),酵母酪氨酸tRNA前体的加工,早转录本,成熟tRNA,加工,真核生物和原核生物转录的差别,DNA,核,核糖体,新生蛋白质,真核生物,原核生物,mRNA前体,转运,加工,mRNA,mRNA, 真核生物中转录与复制在不同的区域 RNA聚合酶不相同 启动子不同 转录后RNA加工修饰不同,噬菌体Q的合成,A. 负链的合成,B. 正链的合成,病毒的正链,复制中间体,复制中间体,新合成的正链,新合成的负链,负链,第三节 核酸合成的抑制剂, 核苷酸合成抑制剂,氨基酸类似物 叶酸类似物 碱基和核苷酸类似物,嵌合剂 烷化剂, 与DNA模板结合的抑制剂, 作用于DNA聚合酶或RNA集合酶的抑制剂,抗菌素:如利福平、曲张霉素 有机化合物：如磷羧基乙酸,第四节 基因工程及分子生物学 技术简介,一、基因工程 二、体细胞克隆技术 三、聚合酶键式反应（polymerase chain reaction, PCR）,一、基因工程简介,基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术的方法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning，克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。,基因工程的操作技术 基因工程的应用与前景,基因工程的操作技术,1、体外基因重组 目的基因的制备 载体的构建：质粒或噬菌体 目的基因与载体重组,2、重组体DNA的转化增殖和表达 转化 筛选 增殖和基因表达,大白鼠的生长激素基因插入到一个质粒中去，在金属巯基蛋白启动子旁边，这个启动子被金属镉所活化,三、PCR技术原理示意图,DNA和RNA合成的比较,基因工程的应用和前景, 建立基因文库。基因文库的建立有利于研究基因结构、基因表达调控机制、个体发育和繁殖的机理、疾病发病机制等，最终将导致遗传育种、疾病基因治疗发生革命性进步。, 生产某些珍贵的生化药物，如干扰素、