药物分析供试品前处理与测定方法效能指标.ppt

第四章 样品前处理与分析方法验证,1. 定量分析样品的前处理方法 1. 概述,含卤素药物,与芳环连接,牢固； 与脂肪链C连接,不牢固。,含金属 药物,金属盐或配位化合物,如酒石酸锑钾等,不牢固； 金属原子直接与碳原子结合,如卡巴胂,牢固。,2. 不经有机破坏的分析方法 (1)直接测定法：金属原子不直接与碳原子相连，如富马酸亚铁； (2)直接回流后水解测定法： 含卤素药物 +NaOH回流间接银量法测定(加过量AgNO3再用 NH4SCN返滴定),(3)硫酸水解后测定法 (4) 氧化还原后测定法 a. 碱性还原后测定法，如泛影酸的测定,Na I + AgNO3 AgI +NaNO3,+NaI,b. 酸性还原后测定法，如碘番酸的测定 碘番酸 +HAc +Zn I- 银量法测定,c. 汞齐化法：,d. 利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量,3. 经有机破坏的分析方法,4. HNO3-HClO4 法,适用于血、尿、组织等,4. HNO3-H2SO4 法,不适用于含碱土金属有机药物,3. H2SO4 -硫酸盐法,含砷、锑有机药物,2. 灼烧（干法） 420 0C,1. 氧瓶燃烧法,不适用于含易挥发性金属有机药物,氧瓶 燃烧法, 硬质瓶(测F时用石英瓶) 称样 先通氧气后点火 吸收液(H2O或H2O+NaOH等),碘苯酯,I2(I-),I-,IO3-,I2,S2O32- 滴定,三氯叔丁醇,胆影酸,泛影酸,碘他拉酸,碘番酸,碘苯酯,盐酸胺碘酮,诺氟沙星,醋酸氟轻松,磺溴酞钠,葡萄糖酸锑钠,富马酸亚铁,酒石酸锑钾,汞撒利,卡巴胂,2. 生物样品分析的前处理技术,目的：,(1) 药物进入体内后，经吸收、分布、代谢，然后排出体外。在体 液、组织和排泄物中除了游离型药物之外，还有药物的代谢物、 药物与蛋白质形成的结合物、以及药物或其代谢物与内源性物 质 (如葡萄糖醛酸、硫酸形成的葡萄糖醛酸苷、硫酸酯缀合物)等 多种形式存在，需要分离后测定药物及代谢物； (2) 生物样品的介质组成比较复杂，主要影响是蛋白质。,1. 常用样品的种类、采集和贮藏 1. 血样 血浆的制备：将采取的血液置含有抗凝剂(肝素、草酸盐、枸橼酸盐、 EDTA、氟化钠等)的试管中，混合后，以25003000rpm 离心5min使与血细胞分离，分取上清液即得。,血清的制备：将采取的血样在室温下至少放置30min到1hr，待凝结 出血饼后，用细竹棒或玻璃棒轻轻地剥去血饼，然后 以2000 3000rpm离心分离5 10min，分取上清液即 得。,药物结合型,游离型,不能通过血管壁,保存：,4 0C,-20 0C,(1) 唾液,由腮腺、颌下腺、舌下腺和口腔粘膜内许多散在的小腺体分泌液混合组成。, 1.0031.008 pH 6.27.6, 不受时间、地点限制，可反复采集 无痛苦、无危险 有些唾液中药物浓度可以反映血浆 中游离型药物浓度,(2) 尿液,采集方式,随时尿 晨尿 白天尿 夜间尿 时间尿,自然排尿,立即测定，超过 24hr应加防腐剂 (苯、甲苯、醋酸、浓HCl),2. 生物样品分析前处理技术 根据生物样品的类型进行分离、纯化。如血浆或血清需除蛋白，使药物从蛋白质结合物中释放；唾液样品则主要采用离心沉淀除去粘蛋白；尿液样品常采用酸或酶水解使药物从缀合物中释出，当原型药物排泄在尿中时，可简单地用水稀释一定倍数后进行测定。, 样品处理步骤与分析方法的选择,(1) 去除蛋白质：,a. 加入与水相混溶的有机溶剂，如乙睛、甲醇、乙醇、 丙醇、丙酮、四氢呋喃，使蛋白质分子内及分子间 的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，使与蛋白质结合 的药物释放出来； b. 加入中性盐，使溶液的离子强度发生变化，使蛋白 质脱水而沉淀，如饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷 酸盐及枸橼酸盐等；,c. 加入强酸，使蛋白质形成不溶性盐而沉淀，如 10%三氯醋酸，6%高氯酸、硫酸-钨酸混合液及5% 偏磷酸等； d. 加入含锌盐及铜盐的沉淀剂，分取上清液，如 CuSO4-Na2WO4、ZnSO4-NaOH等； e. 酶解法：加蛋白水解酶中的枯草菌溶素，既可使组 织酶解，又可使药物析出。,(2) 缀合物的水解：尿中药物多数呈缀合状态 酸水解（HCl） 酶水解(葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶),(3) 分离、纯化与浓集： a. 液-液提取法(乙醚或氯仿) b. 液-固提取法(小规模的柱色谱法，用青 水性硅藻土和疏水性活性炭、聚苯乙烯等),(4) 化学衍生化： a. 使药物变成具有能被分离的性质； b. 提高检测的灵敏度； c. 增强药物的稳定性； d. 提高对光学异构体分离的能力。,3. 测定方法的效能指标,(1) 精密度(Precision):,测定同一匀质样品的一组测量值彼此符合程度,衡量方法,批内精密度 5% 批间精密度 15%,(2) 准确度(Accuracy)：测定结果与真实值接近的程度,85 115%(样品浓度200g/l) 80 120%(样品浓度200g/l),(3) 检测限(Limit of Detection): 指分析方法能够从背景信号中区分 出药物时，所需样品中药物的最低 浓度，无需定量测定。,LOD,(4) 定量限(Limit of Quantitation): 指在保证具有一定可靠性(一定准 确度和精密度)的前提下，分析方 法能够测定出的样品中药物的最 低浓度。,LOQ,(5) 选择性(Selectivity):,指在样品介质中有其他组分共存时该分析方法对供试物质准确而专属的测定能力。, 专属性,一种方法仅对一种分析成分产生唯一信号； 选择性则可对多种化学成分产生不同响应，而主要成分的响应可与其他响应区分。, 线性与范围(Linearity and Range): (6) 线性：在给定范围内获取与样品中供试物浓度成正比的 试验结果的 能力 (7) 范围：利用同一种方法取得精密度、准确度均符合要求的试验结果， 而且成线性的供试物浓度的变化范围，其最大量与最小量之 间的间隔，可用 mg/l mg/ l或 g/l g/l 表示。 Y=a+bx r0.9900, 重现性(再现性) (Ruggedness):,不同人、不同实验室、不同仪器，共同对同一样品的某物理量进行反复测量，其结果接近的程度, 重复性,同一人、同一实验室、同一仪器，对同一样品反复测量，测量值之间接近的程度。,评价其保持不受参数微小变化影响的能力，并可作为正常使用的一个可靠性指标。,(8) 耐用性(粗放度)(Robustness):, 与参比方法测得结果的相关程度的比较：, 要求：r 0.95 b 1,药典要求