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引物设计的一般原则 郭大伟,引物设计的一般原则,1.引物长度 7.发卡结构 2.GC% 8.二聚体 3.Tm值 9.错配 4.3端碱基要求 10.交叉二聚体 5.5端碱基要求 11.产物长度 6.G 值 12.评分,引物长度,引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-24 bp，但不应大于38。 引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。 例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200 ).而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个. 较长的引物（28-35bp) 一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点,GC%,引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。,Tm值,Tm DNA溶解温度，即DNA的双链失去一半时的温度。 Tm 值计算的经验公式 Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 退火温度一般低于Tm，退火温度越高，特异性越高，但杂交率越低。PCR退火温度一般是55，变性温度94， Tm一般在58-70 之间比较合适。 两个引物之间的Tm值应尽可能接近，不应超过4,3端碱基要求,引物3端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加,3端碱基要求,5端碱基要求,5端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。,G 值,G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G 值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G 值相对较高的引物。引物的3端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（能值越高越容易结合） G高于4.5时易引发产生引物二聚体和发夹结构,发卡结构,Hairpin 一条引物自身碱基之间发生配对,二聚体,Dimer 同一条引物的两条连之间发生碱基互补配对,错配,Fals priming 引物与模板的发生配对的位置不止一个。尽管只有某一处可以与引物完全配对吻合，但是其它位置也可与引物之间发生不完全配对，影响延伸。,交叉二聚体,Cross dimer 两条引物之间发生碱基配对,产物长度,Product
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