基因突变对于骨髓增殖性肿瘤的分类诊断和治疗的意义.ppt

1、MPD：是一系或多系分化相对成熟的骨髓细胞不断的克隆性增殖所致的一组肿瘤性疾病的统称。 2、MPD包含慢性粒细胞白血病（CML），真性红细胞增多症（PV），原发性血小板增多症（ET），和原发性骨髓纤维化（PMF）,慢性中性粒细胞白血病（CNL），慢性嗜酸细胞白血病/高嗜酸细胞综合症（CEL/HES）等多种疾病。,一、骨髓增殖性疾病（MPD）,MPD的病因和发病机制尚未完全明确。2005年发表在Nature上的一篇文章首次报道了JAK2突变发生于多种MPD，在他们的研究中，约80的PV患者存在JAK2基因突变，导致基因编码产物第617位氨基酸由缬氨酸突变为苯丙氨酸。,二、MPD发病机制,这一变化导致JAK激酶相关的特异性的受体酪氨酸磷酸化活性持续增强，使红细胞对细胞因子如EPO的反应增强，持续激活JAK-STAT信号途径，从而发生PV，这一机制在小鼠模型中得到证实。 同样地，JAK2 V617F也存在于其他MPD中1 。 这个基因突变的发现无疑对MPD的分类、诊断和治疗产生了深远的影响。 1 James C, Ugo V, Le Coudic JP, et al. A unique clonal JAK2 mutation leading to constitutive signalling causes polycythaemia vera. Nature, 2005,434:1144-1148.,三、JAK-STAT信号途径,细胞因子与其相应受体结合后，引起细胞质受体构象的改变，进而激活与受体相关联的JAK激酶，JAK激酶能够使特异性受体的酪氨酸残基磷酸化，进而促使相应的STAT因子磷酸化，从而激活STAT因子。最后，激活的STAT蛋白从受体上游离形成二聚体，进入细胞核内与GAS（gamma activated site）增强子家族成员相结合，诱导靶基因表达。,胞浆,示意图：JAK-STAT信号途径 能够激活JAK2激酶的受体包括：EPO-R,TPO-R,GM-CSF-R,IL-3R,gp130受体家族等。,2 Jones AV, Kreil S, Zoi K, et al.Widespread occurrence of the JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disorders Blood. 2005;106(6):2162-8. 3 Vainchenker W, Constantinescu SN.A Unique Activating Mutation in JAK2 (V617F) Is at the Origin of Polycythemia Vera and Allows a New Classification of Myeloproliferative Diseases.Hematology. 2005:195-200. 4 Nelson ME, Steensma DP. JAK2 V617F in myeloid disorders: what do we know now, and where are we headed? Leuk Lymphoma. 2006 Feb;47(2):177-94. 5 Fei HR, Zhang R, Chen SN, et al.The clinical implication of JAK2 mutation expression in patients with myeloproliferative disorders. Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 2007 Apr;46(4):271-3. 6 Lucia E, Martino B, Mammi C, et al.The incidence of JAK2 V617F mutation in bcr/abl-negative chronic myeloproliferative disorders: assessment by two different detection methods. Leuk Lymphoma. 2008 Oct;49(10):1907-15.,参考文献：,在修订的2008 WHO分类系统中，有无JAK2突变成为MPD主要的诊断指标7 。 （1）如果JAK2突变阳性，血红蛋白增加，骨髓红系细胞明显增生可以诊断PV，即使血红蛋白低于以往WHO规定的指标值，但却持续超过正常值 20g/L的PV也可以确诊。 （2）如果JAK2突变阳性，血小板仅仅持续大于450X109/L,骨髓巨核细胞增生，可以诊断ET。,四、 2008 WHO分类系统,7 Tefferi A and Vardiman JW.Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: The 2008 World Health Organization criteria and point-of-care diagnostic algorithms. Leukemia 2008, 22, 1422,原WHO关于PV诊断标准如下： A1：红细胞比积增高比正常平均值25或血红蛋白男性185g/L、女性165g/L； A2：无引起继发性红细胞增多原因如无家庭性红细胞增多症，无低氧血症（动脉P0292）、无高氧亲和力血红蛋白，无截短的促红素（Epo）受体和无肿瘤分泌EPO所致EPO升高； A3：脾大； A4：骨髓细胞无Phbcrabl，但可有其他克隆性遗传学异常； A5：体外培养有内源性红系集落形成；,B1：血小板增多40010g/L； B2：白细胞1210g/L； B3：骨髓活检示全髓系增生以红系和巨核系增生明显； B4：血清EPO减低； 具有A1+A2+任何A项或Al+A2+B项中任何2项均可诊为PV.,(3)不仅MPD的诊断发生革命性进展，连名称都改变了。MPD改称为骨髓增殖性肿瘤(myelo- proliferative neoplasm，MPN)，MDS/MPD(myelodysplastic /myeloproliferative disorder)称为MDS/MPN。新分类的MPN 中还包含了肥大细胞病（MCD）。,(4)以前的慢性嗜酸细胞白血病/高嗜酸细胞综合症（CEL/HES）分别重新划分为CEL，HES和有PDGFRA, PDGFRB或者FGFR1基因异常的嗜酸细胞增高症3种MPN，并强调这类疾病的本质是肿瘤. 现已明确，MPN具有共同的干细胞起源的克隆型遗传特征，临床出现不同表型是突变影响的蛋白、酪氨酸激酶及相关分子的不同构型和异常的信号转导所造成的。,1、MPN诊断标准的依据:多数患者都具有JAK2突变，主要是JAK2 V617F, 还有JAK2外显子12突变。由于JAK2 V617F是髓系细胞特异性的，在PV以外其他原因造成的红细胞增多症并不出现，因此是PV的一个敏感的诊断标记。,五、JAK2突变对于MPN的诊断意义,2、但是，髓系肿瘤中JAK2 V617F并非PV独有， 还可见于50%的ET或PMF。但其他髓系肿瘤JAK2 V617F发生频率很低，淋巴系肿瘤不出现。仅检测JAK2 V617F 突变虽然不能单独用来区分不同类别的MPN，但是结合骨髓活检的组织学依据，可以诊断ET和PMF，排除反应性的血小板增多和骨髓纤维化。,3、JAK2 突变在PV诊断中意义最大，而诊断ET或PMF时则可能未发现JAK2 V617F，原因除了大约一半患者的确无突变外，还因为目前的检测方法并没有标准化。 4、应用直接测序、位点特异性PCR和荧光定量PCR检测JAK17F基因突变的方法会出现一些差异。不同方法的检测灵敏度不同，突变检出率可能不同。通常直接测序检测的灵敏度约20-25%，位点特异性PCR方法约1-3%，荧光定量PCR方法约0.5-5% 79 。,参考文献：,7 Murugesan G, Aboudola S, Szpurka H, et al. Identification of the JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disorders using FRET probes and melting curve analysis. Am J Clin Pathol, 2006, 125:625-633. 8 Vannucchi AM, Pancrazzi A, Bogani C, et al. A quantitative assay for JAK2(V617F) mutation in myeloproliferative disorders by ARMS-PCR and capillary electrophoresis. Leukemia, 2006, 20:1055-1060. 9 McClure R, Mai M, Lasho T. Validation of two clinically useful assays for evaluation of JAK2 V617F mutation in chronic myeloproliferative disorders. Leukemia, 2006,20:168-171.,5、突变类型：携带纯合型还是杂合型等位基因以及突变细胞的比例都与临床症状有关，对MPD并发症的发生率及预后都有重要意义； PV患者较ET或IMF患者更多携带纯合型突变细胞10、11 。,10 Ross L. Levine, Claude Belisle, et al. X-inactivationbased clonality analysis and quantitative JAK2V617F assessment reveal a strong association between clonality and JAK2V617F in PV but not ET/MMM, and identifies a subset of JAK2V617F-negative ET and MMM patients with clonal hematopoiesis. Blood, 2006,107:4139-4141. 11 Linda M. Scott, Mike A. Scott,et al. Progenitors homozygous for the V617F mutation occur in most patients with polycythemia vera, but not essential thrombocythemia. Blood, 2006, 108:2435-2437.,6、突变量：临床工作对患者杂合型/纯合型突变克隆的携带情况，突变比例的定量检测也越来越重视。转染JAK2 V617F突变基因的小鼠模型可出现类似PV的表型，突变基因表达量进一步增高时可以进展为骨髓纤维化，而在突变基因低表达的小鼠模型中可以观察到一过性的血小板增多12 。,MPD疾病过程中临床症状和JAK2 V617F突变携带比例的变化很可能与杂合型突变向纯合型突变的基因转变有关13 。,12 Lacout C, Pisani DF, Tulliez M,et al. JAK2V617F expression in murine hematopoietic cells leads to MPD mimicking human PV with secondary myelofibrosis. Blood, 2006, 108:1652-1660. 13 Campbell PJ, Scott LM, Buck G, et al. Definition of subtypes of essential thrombocythaemia and relation to polycythaemia vera based on JAK2 V617F mutation status: a prospective study. Lancet, 2005, 366:1945-1953.,7、JAK2基因突变的发现也导致其他临床诊断指标的变化。PV患者血红蛋白增加或者血细胞容积增加是诊断重要的指标，但并非总是和体内红细胞总量真正增加（红细胞增多症）相一致。PV有时候可以表现为红细胞压积正常，是因为血浆也相应增加了。,既然如此，那么在经典MPN(PV, ET 和PMF)血红蛋白和血细胞容积也不一定有明显区别。过去PV专业协作组（PVSG）建议在诊断PV时使用红细胞总量 (RCM) 来克服上述缺点，2001年的WHO标准开始强调要做骨髓活检来帮助诊断。,（1）PV：既然几乎所有PV患者有JAK2突变，外周血JAK2V617F检测是当前PV患者首选的检查。与此同时，应当检测血清Epo水平，真正的PV同时出现JAK2 V617F阴性和Epo水平正常或增加的可能性非常小，血清Epo水平（减低）检测能够发现极少见的JAK2 V617F阴性的PV。,另一方面，也应该考虑检测JAK2 V617F阴性，血清EPO水平正常或者低下患者的JAK2外显子12突变和骨髓活检。骨髓细胞学变化也是ET，PMF和JAK2突变阴性的PV必须的诊断标准之一。,（2） ET、PMF：因为JAK2 V617F见于50% 的ET或PMF，诊断血小板增多和骨髓纤维化患者时应考虑JAK2突变。突变出现可以排除反应性骨髓增殖，然而没有检出突变并不能排除MPN的可能性。诊断ET和PMF时通常也需要骨髓检查。,同样，ET或PMF类似CML时，尤其是在未发现JAK2 V617F时，在骨髓检查之初就要考虑细胞遗传学检查。如果没有发现Ph染色体，但是骨髓有小巨核细胞时，应考虑做FISH检测BCR-ABL基因。,WHO诊断标准(见下页),阳性指标 1.持续性BPC600109L 2.骨髓活检以巨核细胞系增多为特征，巨核细胞体积较大，多为成熟型 阴性指标 1.无PV证据：骨髓铁染色正常，红细胞数正常或Hb185 g/L(男)或165 g/L(女)2.无CML证据：无Ph染色体，无bcr-abl融合基因 3.无慢性IMF证据：无胶原纤维，无或极少网状纤维 4.无MDS证据：无del(5q)，t(3；3)(q21；q26)或inv(3)(q21q26)等染色体异常，无明显的粒细胞增生异常，无或极少有小巨核细胞 5.无以下原因引起的反应性血小板增多：炎症、免疫、肿瘤或先前已切脾3ET的治疗,（3）不典型MPN：诊断不典型MPN (CNL, HES, CEL-NOC,MCD 和不能分类的MPN)时，通常要求BCR-ABL阴性, 有红系造血异常，粒细胞发育异常，或者单核细胞发育异常（1x109/L）。,（4） CNL：如果外周血白细胞25x109/L 伴随80%分叶核中性粒细胞或带状中性粒细胞，不成熟粒细胞10%和原始粒细胞1%（骨髓中5%原始细胞）时，考虑CNL。,（5）不能分类的MPN：如果发现骨髓形态学异常的肥大细胞聚集，怀疑MCD的时候，应当考虑类胰蛋白酶染色检查骨髓，做流式细胞仪分析寻找形态异常的肥大细胞 (CD25阳性), 如果有可能最好进行KIT D816V突变检测。当临床表型和经典的或者其他非经典的MPN的诊断标准不符时候，可考虑不能分类的MPN。,（6）CEL-NOC、HES：CEL-NOC包含伴有嗜酸细胞增多的PDGFRA,PDGFRB 和FGFR1重排的髓系肿瘤。诊断两者都需要外周血嗜酸细胞计数1.5x109/L，排除继发性嗜酸细胞增多，排除其他急慢性髓系肿瘤，并且没有表型异常和/或克隆性T淋巴细胞。诊断HES需要没有细胞遗传学异常，外周血原始细胞2%或骨髓原始细胞5%两个条件。,基因检测在疾病诊断中愈来愈重要，从1960年在CML中发现了Ph染色体时开始， 除Ph染色体的特征性BCR-ABL基因，陆续在PV, ET和PMF中发现JAK2 V617F，PV中JAK2外显子12突变；在ET或PMF中发现的PLW515L/K，在伴有嗜酸细胞增多症的髓系恶性肿瘤中发现的PDGFRA, PDGFRB 或 FGFR1基因重排，在MCD中发现的KITD816V和其他KIT突变，在幼年型粒单细胞白血病（JMML）中的发现RAS通路突变（包括 RAS, PTPN11 或者NF1）。,这些与髓系恶性肿瘤发病相关的基因的发现，最终将导致一些新分类和诊断方式。例如，检测 FIP1L1- PDGFRA突变(用FISH 或者 RT-PCR)，PDGFRB-重排(用染色体核型或 FISH)，或者FGFR1易位 (用染色体核型)都是目前原发性嗜酸细胞增多症分类及选择治疗方案的必要检查。,既然JAK2突变广泛存在于MPN，那么，抑制JAK2基因来治疗MPN的药物也就具有相当的应用前景，如抑制JAK2基因表达的药物TG101209, Go6976, erlotinib都有应用于临床治疗的可能。,六、JAK2突变对于MPN的治疗意义,1、TG101209 2007年Pardanani A 等人研制出一种口服的生物小分子TG101209，能抑制JAK2 激酶(IC(50)=6 nM), 而对于其他的激酶如JAK3 抑制作用较弱(IC(50)=169 nM)。它能够抑制表达JAK2V617F 突变的Ba/F3细胞（小鼠原B细胞株）的生长。在人类表达JAK2V617F 突变的急性髓系白血病细胞株中， TG101209能够促进细胞凋亡，抑制JAK2V617F、STAT5 和 STAT3的磷酸化。这就预示着它可能治疗MPN，且其治疗作用在裸鼠模型中得到证实。,2、Go6976 2006年Grandage VL 等人证实G6976在体外实验中能直接抑制 JAK2. G6976还能抑制表达MPN相关的JAK2 V617F突变的细胞以及表达白血病相关的TEL-JAK2融合蛋白的细胞的