分子免疫学基因工程抗体.ppt

1,基因工程抗体,Bo Gao, Ph.D.,Email: Tel: 54237154,2019-9-30,2,1888年 Roux/Yersin 白喉外毒素 1890年 Behring/Kitasato 抗毒素；血清疗法 1939年 Tiselius/Kabat g-globulin 1959年 Porter Fab 、Fc 1962年 Edelman H、L 1962年 Porter Fab(H+L)、Fc(H),1975年 Kohler/Milstein McAb 1980年 Tonegawa Ab diversity 1984年 Sharon Engineering antibody 1989年 Winter/Lerner Antibody Libraries,3,Emil von Behring, 1901, antitoxins,Georeges Kohler and Cesar Milstein, 1984, monoclonal antibody,Susumu Tonegama,1987, structure of Ig gene,Gerald Edelman and Rodney Porter, 1972, structure of antibody,Paul Ehrlich , 1908, production of antibody,Nobel Prize winners,4,5,6,7,抗体占所有生物技术药品的25% 2019年440亿美元 2019年将超过980亿美元 2019年TOP50的生物药物14个是抗体药物，前六位均是抗体药物,抗体相关信息,8,9,10,11,12,13,14,15,16,抗体的发展,抗血清的制备：19世纪末，Behring 单克隆抗体：1975，Koehler和Milstein Nature 1975 Aug 7;256(5517):495-7 Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. 基因工程抗体：1984，Sharon Nature 1984 May 24-30;309(5966):364-7 Expression of a VHC kappa chimaeric protein in mouse myeloma cells.,17,抗血清（多克隆抗体）的制备,Foreign proteins,Viruses,Bacteria,Parasites,Fungi,Antigens,B cell,B cell activated,Humoral response,Plasma cells secrete antibodies,+ TH cell,Antigen,+,Vertebrate body,18,多克隆抗血清,对健康人用疫苗进行主动免疫，免疫前（a）和免疫后10天 （b）分别采血并对血清蛋白进行凝胶电泳分析。免疫前血清中的球蛋白条带较宽，免疫之后则相对集中。Bruton 氏病患者血清蛋白中的球蛋白条带缺失（c）。,19,小鼠体系：半衰期短、HAMA 大鼠体系：单抗腹水比小鼠高10倍，易亲合层析 人 体 系：人鼠杂交瘤、人人杂交瘤,单克隆抗体的制备,20,21,杂交瘤细胞的选择性培养,DNA合成的途径：,氨基喋呤,(Aminopterin,A),糖+氨基酸,核苷酸,胸腺嘧啶核苷 (Thymidine,T),TK,TMP,次黄嘌呤,IMP,HGPRT,核苷酸前体,DNA,(Hypoxanthine, H),22,融合后细胞在HAT培养基中存活情况 脾细胞（ HGPRT+, TK+, 不能长期生长） 骨髓瘤细胞（ HGPRT-, TK-，不能生长 ） 杂交瘤细胞（ HGPRT+, TK+ ，能够生长）,23,蛇毒单抗的制备,24,25,鼠源单克隆抗体的应用,基础研究,细胞抗原研究及鉴定分类,细胞受体研究,分子克隆及功能研究,医学研究及诊断,感染性疾病诊断,肿瘤诊断及预后判断,其它诊断及研究,不足：半衰期短、人抗鼠抗体反应（HAMA）,26,将制备单抗的细胞工程技术与生产重组分子的基因工程技术和蛋白质工程技术结合起来，对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新组装，转染适当的受体细胞后表达出抗体分子，这种经基因重组的抗体称为基因工程抗体。,基因工程抗体,概 念,27,1. 从杂交瘤或免疫脾细胞、外周血淋巴细胞等提取mRNA 逆转录成 cDNA 2. PCR分别扩增出抗体的重链及轻链基因 3. 构建表达载体 4. 在适当的宿主细胞中表达并折叠成有功能的抗体分子 5. 筛选出高表达细胞株 6. 亲和层折等手段纯化抗体片段,基因工程抗体,基本原理,28,基因工程抗体,人源化(Humanization)抗体,29,Humanization （Chimeric/Reshaped Antibody),Constant region(Fc),Mouse antibody,Antigen-binding region(Fab),Antigen-binding regions from mouse,Specifiv antigen-binding sites from mouse,Chimeric antibody (66%),Fully huamn antibody (100%),Humanized antibody (90%),30,FR：为CDR的构象提供环境；参与抗体结合位点正确构象的形成 ； 简单的CDR移植会丧失或降低原亲本抗体的亲和力 方法：模板替换 较大同源性人FR替换鼠FR 表面重塑 对鼠CDR及FR表面残基镶饰或重饰类似人 补偿变换 CDR移植后更换部分的人FR鼠 定位保留 以人FR保守序列为模板进行人源化,人源化抗体的构建策略,31,从同源抗体或抗体的共同序列中选择人源FR 确定在FR中起关键作用的氨基酸 以鼠单抗可变区的立体模型作指导,人源化抗体的构建策略,关 键,目 标,保持抗体的亲和力 降低免疫原性,32,从分泌某种鼠单抗的杂交瘤细胞基因组中分离并鉴定出重排的功能性V区基因，并与人抗体C区基因按一定的方式重组，克隆到表达载体中构建鼠人嵌合的轻重链基因表达载体，再转入宿主细胞表达，经筛选后制备成特异性的嵌合抗体。,人鼠嵌合抗体,概 念,33,PCR,鼠抗体基因,人抗体基因,VL CL,VH CH1CH2 CH3,VL CL,VH CH1CH2 CH3,嵌合轻链,嵌合重链,IgG,34,人鼠嵌合抗体,特 点,完全保留鼠单抗的特异性和亲和力,降低了HAMA不良反应,一定的免疫原性，V区完全鼠源性,35,改型抗体,抗体分子轻、重链可变区的6个CDR形成CDR平面直接接触抗原，决定了抗体的特异性，骨架区只是作为支持CDR襻的支架，而且其立体构象极为保守。因此，将鼠单抗的CDR移植到人单抗的骨架区上，有可能使人单抗获得鼠单抗的特异性，并最大限度地减少鼠单抗的异源性，仅有9%的序列来源于亲本鼠单抗，这种CDR移植的人单抗称为改型抗体。,36,CDR序列,CDR序列,鼠单克隆抗体,人抗体,人源化抗体（改型抗体）,鼠单克隆V区人源化（CDR移植）,37,治疗性抗体的开发几经反复终于形成蓬勃发展-鼠单抗人源化的技术功不可没。 鼠单抗人源化时基本选择IgG同种型，在体内IgG与存在于内皮细胞表面的受体FcRn相互作用，在细胞内受到保护不被降解而具有较长的半衰期。 同时鼠IgG通过激活补体和结合Fc受体激发一系列生物效应功能的效率较低，无论是嵌合抗体还是改型抗体均通过使用人恒定区克服了这一缺陷。,人源化抗体的评价,38,对于人源化的最主要的初衷，消除异源性的评价却要复杂的多。,除了降低抗体分子的鼠源序列外，其免疫原性还受到其它因素如给予抗体的途径和剂量、病人的病情和免疫状况、抗体所针对的抗原的特性和部位以及抗体本身激活生物学效应的特性等均相关，因此应该综合考虑。,人源化抗体的评价,39,不同种属之间抗体分子可变区的差别远低于恒定区的差别； 构建改型抗体要比构建嵌合抗体的工作量大的多，还常常导致亲和力不同程度的降低，付出亲和力和增加研制成本的代价是否值得的问题。,人源化抗体的评价,改型抗体相对于嵌合抗体的优越性存在质疑：,40,应当制备配对的改型和嵌合抗体，用于足够量的可比较的人群，观察其诱发抗抗体的生成情况，这是难以做到的。 迄今大量临床应用的情况揭示其他影响免疫原性的因素值得重视，因此一味追求序列的同源性而摒弃嵌合抗体是值得商榷的。 事实上即使完全人源化的抗体也可以诱发抗独特型抗体，并不可能完全消除治疗性抗体的免疫原性，而这种抗独特型反应的后果如何待进一步观察。,人源化抗体的评价,欲确切评判人源化对免疫原性的影响：,41,V区片断，1/31/80，具有与抗原结合的功能 种类：Fab抗体 单链抗体（ScFv） Fv片断抗体 单域抗体SDAb 最小识别单位MRU,小分子抗体,42,(1) 小分子抗体,43,组成：由重链V区及CH1功能区与轻链二硫键连接，50KD， 为完整IgG的1/3。 应用前景： 较好的渗透性和药代动力学特征 HAMA反应存在 亲和力较低、稳定性差,Fab抗体,44,将抗体分子的重链V区和CH1功能区的cDNA与轻链完整的cDNA序列重组并克隆到适当的表达载体中 在大肠杆菌等宿主细胞中表达 整个制备过程包括Fab抗体基因的扩增，表达载体的构建、表达及产物鉴定,基因工程手段构建Fab抗体的原理,45,Fab抗体基因的扩增方法,Fab基因扩增的方法主要有二种：,采用PCR技术直接从基因组中扩增，但这种方法不确定的影响因素较多。,通过RT-PCR技术从cDNA中扩增,两种方法成功的关键均取决于PCR引物的设计。不同Fab抗体引物的设计有所不同，但一般均使用同源性较高的序列，其中5端的引物必须包含克隆位点，3端的引物除克隆位点外还应含有翻译终止信号。,46,免疫球蛋白 基因载体的构建,H链表达载体,L链表达载体,共转染细胞,Pr VH CH1 Pr VL CL,Fab 抗体分子的制备,Fab抗体,47,抗体分泌细胞,VH,VL,CL,-S-S-,CH1,Fab 抗体分子的制备,Fab抗体,48,单链抗体（ScFv）,组 成,特 点,VH和VL通过连接肽重组表达,分子量小、穿透力强、体内循环半衰期短、免疫原性低 可作为其它抗体的基本元件,49,单链抗体基因的构建一般采用从杂交瘤细胞提取mRNA，反转录成cDNA，通过PCR扩增其VL及VH基因，再用人工合成的寡核苷酸序列即接头把VL的C端与VH的N端或VH的C端与VL的N端连接，即成单链抗体基因。,单链抗体（ScFv）,构建方法,50,VH VL,接头DNA (Gly4Ser)3,VH引物,PCR,VH 接头DNA,酶切、克隆,ScFv (single chain Fv,scFv )的构建,变性、复性,VL引物,VL,单链抗体（ScFv）,51,单链ScFv：抗原含重复抗原决定簇时，亲和力下降8倍以上 双价ScFv：改善ScFv的亲和活性 双特异性ScFv：与细胞因子IL-2、TNF相连：特异性杀伤,应用前景,52,保持抗体的可溶性 接头：长度、V区空间结构,组 成,单域抗体,一个VH或VL功能结构域,特 点,分子量小Ig分子的1/12、抗原性弱、穿透力强 抗原性弱、相对较粘（疏水面的暴露有关。在全抗体分子中，疏水面被VL遮盖） 细菌LPS的单域抗体在杂交瘤细胞中的表达量比亲本单克隆抗体高50倍以上,设计原则,53,最小识别单位(minimal recognition unit,MRU),组 成,高多变区多肽（hypervariable region polypeptides,HRP）,一个CDR多肽,特 点,设计原理,应 用,1630氨基酸、抗原性弱、穿透力强 非特异性吸附,每个CDR的作用不同 寻找在抗原识别和亲和力方面有重要意义的CDR,抗血小板纤维蛋白原受体CDR3，抑制纤维蛋白原、PACI与血小板的结合,54,传统单抗分子量大，穿透力弱 基因工程小分子抗体穿透力强，亲和力低 多价微型抗体 双链抗体（diabody） 双特异性抗体（bispecific antibody） 微型抗体（minibody） 三链抗体（triabody） 四链抗体（tetrabody）,多价微型抗体,55,VLVHCH3 80kD 易于构建及生产 血中停留时间长 靶部位吸收好,CH3- dimerized scFV,微型抗体,56,LD型 LD,LEPKSCDKTHTCPPCGGGSSGGGSG,Flex型连接肽序列,CH3,57,价肽取决于连接肽段所形成的聚合物特性,多价ScFv与单价ScFv和Fab片断相比，与靶抗原结合的功能亲和力提高,四链抗体,4 helix- stabilized scFv tetramers,58,Leucine-zipper stabilized scFv dimers,Helix- stabilized scFv dimers,4 helix- stabilized scFv tetramers,Streptavidin-scFv,scFv fusions with di- and multimeriaztion domains,59,双链抗体的分子量为60KD左右，三链抗体为90KD左右，二者均显著大于ScFv单体的分子量(约30KD)。因而在体内应用多价微抗时，可以降低抗体在循环中的清除速度，但这种优势也可能因穿透能力的降低而抵消。 双链抗体和三链抗体的较短接头不易被蛋白酶水解，而单价ScFv的较长接头却易被水解。 多价ScFv与单价ScFv和Fab片段比较，最突出的特点是与靶抗原结合的功能亲合力提高。 ScFv多聚体能同时结合几个靶抗原，也可多价结合于癌细胞的表面，因而具有较高的亲和力。,单链抗体、双链抗体、三链抗体及多价抗体的比较,60,人-鼠嵌合抗体 鼠源V区或Fab 150 25%30% 人源C区或Fc 改型抗体 以鼠源CDR 150 15% 替换人源CDR 双特异性抗体 异源性H2/L2 150 小分子抗体 Fab 完整L和部分H 50 15 Fv VH和VL 25 15 单链抗体 VH-连接肽-VL 26 15 单域抗体 VH 12.5 7.5 最小识别单位 单一CDR 2 1.5,基因工程抗体的种类及其特性,种 类 基本结构 相对分子量（kD） 鼠源性成分,61,BsAb，两个不同的VL和VH两个不同的抗原结合位点,双特异性抗体,62,CTL,CD3,TUMOR CELL,-S-S-,VH,CH1,VL,-S-S-,CH1,抗原A,抗原B,双特异性抗体,63,双特异性抗体,64,1. 高效的表达、筛选抗体的体系 将表型（与抗原特异结合）和基因型（含有片段抗体基因）联系起来，使识别抗原的能力与进行再扩增的能力结合在一起，可以模拟生物体内B细胞的有关特性识别与扩增的统一。 2. 绕过免疫制备全人源性抗体，避免了鼠源性抗体在人体 应用时诱发的HAMA等不良反应。 噬菌体抗体库技术的出现及噬菌体抗体的研制成功已成为生命科学研究的突破性进展之一。,噬菌体抗体,特 色,65,以噬菌体为载体，将抗体基因(Fab或ScFv基因等)与噬菌体编码的外壳蛋白(cp)或(cp)相连，在噬菌体表面以抗体-外壳蛋白融合蛋白的形式表达； 经辅助病毒感染后，借助cp的信号肽穿膜作用，进入宿主外周基质，在正确折叠后被包装于噬菌体尾部，随后携带有表达载体的宿主菌就会释放出带有抗体片段的噬菌体颗粒； 这种噬菌体抗体可以特异识别抗原，又能感染宿主菌进行再扩增； 采用类似于亲和层析原理从噬菌体抗体库中筛选出特异性抗体。,噬菌体抗体,基本原理,66,1 Insert Fab genes into phages 2 Infected bacteria make new phages 3 Screen the phages specific to the antigen 4 Add the selected phages back to bacteria 5 Put the Fab onto Ab backbones,Phage-displace can be used instead of hybridomas,噬菌体抗体,67,噬菌体抗体的克隆和表达,antigen,antigen,Repertoire of diverse sequences displayed on phage,Incubation of phage-displayed repertoire with antigen,Elimination of unbound phage,Elution of bound phage,Selection of ligands from phage-display libraries,68,噬菌体抗体库技术的产生主要依赖于三项实验技术的发展： 1. PCR技术的发展使人们可以用一组引物克隆出全套Ig 的可变区基因。目前已设计出了多套扩增VH和VL基 因的引物。 2. 从大肠杆菌内分泌有结合功能的Ig分子片段获得成 功。这一成功说明了用抗体库在原核细胞筛选特异 性抗体的可行性。,噬菌体抗体,69,3. 有效的筛选系统（噬菌体表面表达技术）的建立 将肽链通过与单链噬菌体外壳蛋白（p或p）融合表达在丝状噬菌体（fd、M13）的表面，利用其可以再扩增的特性，将靶分子固定化，通过亲和筛选-洗脱-扩增，可筛选到靶分子的配体肽链或Fab段。 两种丝状噬菌体呈现系统，外壳蛋白 cpIII系统及cpVII系统。 其中cpVIII系统是一种多价选择系统,可同时呈现多达2O00拷贝/噬菌体的多拷贝结合蛋白，因而可以大大提高亲和力较低的抗体片段的整体亲和性，更有利于筛选得到阳性克隆 cpIII产物仅约4拷贝噬菌体，为单价选择系统，因而筛选获得的抗体亲和力一般较高。,噬菌体抗体,70,筛选技术的发展 筛选抗细胞表面抗原抗体 抗原阴性细胞（antigen-negative cell）作为非特异性噬菌体的吸附体 e.g.以人血细胞Rh(D)+为靶细胞，Rh(D)-为非特异性噬菌体吸附体，从而成功地从Fab噬菌体抗体库中筛选出一系列的抗Rh(D)抗体。,噬菌体抗体的克隆和表达,71,高亲和力抗体的获得 1. 模拟体内亲和力成熟的过程 定点突变、模拟体内过程，先造成大量的随机突变，再经抗原选择、在致突变株体内进行突变、半随机突变法 2. 链更替 固定VH基因而置换选择VL基因 选出匹配最好的高亲和力的VHVL组合(亲和力提高20倍) 固定H3VL基因而置换选择H1一H2基因(亲和力提高15倍) 将H1一H2节段(库)与单一H3-VL基因连接(不用接头),噬菌体抗体的克隆和表达,72,高亲和力抗体的获得 3. 增加抗体库的多样性 联合感染技术(combinatorial infection) 增加链组合 105不同的轻链、107不同的重链，用联合感染技术，经Cox P位点使两链在体外有效地组合在同一噬菌体中，这就可以直接分离获得库容量为1012的高亲和力抗体； 提高噬菌粒的包装滴度和提高细菌的转化效率、构建载体时酶切位点的合理选择，以及PCR引物的设计等进行。 4. 分子伴侣辅助噬菌体抗体表达,噬菌体抗体的