感染性疾病基因诊断.ppt

感染性疾病的基因诊断,重点介绍两个内容 分子诊断学 感染性疾病的基因诊断,第一节 分子诊断学,现代生物学和现代医学研究都已经证明，除外伤和非正常死亡以外，人类所有疾病的发生、发展和转归都与遗传物质(DNA)的直接或间接变化相关，这标志着现代医学的发展已逐步进入“基因组医学”时代。,而基因组医学对疾病诊治的首要贡献便是“预测医学”(predictive medicine)。所谓预测医学就是在受精卵及其卵裂期、胚胎期、胎儿期、婴幼儿期或个体发病前期对遗传物质(DNA)的直接或间接变化进行分析，以识别出疾病相关基因的结构异常或功能异常或识别出发病风险基因的携带者，从而进行有效的预防和治疗。,很显然预测医学是以分子诊断(molecular diagnosis)技术为基础的。人类常见的遗传性疾病有150200种，较为罕见的疾病有600800种，它们可能与人类3000040000个基因中的几千个基因相关。,人类基因组DNA全序列数据的公布以及几十种细菌、啤酒酵母、秀丽线虫、黑腹果蝇、拟南芥等多种模式生物全基因组序列测定的完成，都为人类遗传病和感染性疾病的分子诊断奠定了基础。,一、分子诊断学的发展 现代预测医学分子诊断的诞生可追溯到1978年，著名美籍华裔科学家简悦威(YuetWai Kan)首先应用液相DNA分子杂交技术对镰刀形细胞贫血(S)实现了产前基因诊断。,诊断的基本原理 某一疾病的基因与某一遗传性标志连锁在一起，当时的遗传性标志就是限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphisms，RFLPs)，即不同个体的DNA用同一限制酶切割产生片段的大小可不同，而这种不同与某种疾病或疾病的基因连锁在一起，从而间接地诊断疾病。,这之后，基因诊断技术虽然只有短短的20多年历史，但对疾病诊断学的影响作用却是革命性的。遗传标志从第l代的RFLP，到第2代遗传标志(短串联重复序列)，到第3代遗传标志(单核苷酸多态性：SNP)，到直接检测基因；分析的层次从DNA到RNA到蛋白质；,分析的方法 DNA液相杂交和固相点杂交； 基因限制酶酶谱分析； 限制性片段长度多态性连锁分析； RNA杂交； PCR体外扩增；,荧光原位杂交(fluorescence insitu hybridization，FISH)； DNA测序； 生物芯片(DNA chip)技术； 蛋白质印迹； 免疫细胞化学 使传统的基因诊断(DNA诊断)概念发展到更全面的分子诊断(DNA诊断、RNA诊断和蛋白质诊断)的新概念。,1999年3月，美国医学委员会(ABMS)批准美国医学遗传学委员会(ABMG)和美国病理学委员会(ABP)创立一项旨在推动美国分子诊断的认证资格培训计划：分子遗传病理学(MGP)，要求MGP的地位必须等同于医学及人类遗传学和病理学。申请MGP培训的医师必须拥有MD或DO博士学位，并已经获得医学专业委员会颁发的行医资格认证，等等。1999年11月，美国病理学会创办的Joumal of Molecular Diagnostics杂志正式出版，标志着分子诊断的发展掀开了新的一页。,二、分子诊断的常用技术 分子诊断的基础是分析被筛查者的组织细胞、毛发、抗凝血或干血迹，甚至甲醛(福尔马林)固定、石蜡包埋的组织中的基因。,目前用于分子诊断的技术主要包括PCR-STR、原位PCR、FISH、RT-PCR、PCR-RFLP、PCR-SSCP、多重PCR、定量PCR、DNA测序、DCGE、异源双链分析、化学裂解和酶裂解错配分析、蛋白截断测验、质谱法(mass spectrometry)以及DNA芯片等。,1Southern印迹技术 Southern印迹是分析DNA结构的一种技术，由于人体内除了红细胞外几乎所有的细胞均可分离到足量的供Southern分析的DNA，所以用Southern印迹技术可对缺失、重复及点突变引起的疾病诊断。,DNA分子经限制性核酸内切酶酶切，经琼脂糖凝胶电泳将所得DNA片段按分子量大小分离，然后将含DNA片段的琼脂糖凝胶变性，并将其中的单链DNA片段转移到硝酸纤维素膜或其它固相支持物上，而各DNA片段的相对位置保持不变。这种滤膜即可用于下一步的杂交反应。,2Western印迹技术 Western印迹技术是检测特定的蛋白质的方法。X连锁隐性遗传的Duchenne肌营养不良(DMD)是由于基因缺陷而使肌细胞增强蛋白(dystrophin)合成异常，用Western法可检测患者肌细胞增强蛋白，从而对DMD及症状较DMD轻的进行分子诊断,3PCR技术 PCR技术及在此基础上发展起来的RT-PCR、PCR-RFLP、PCR-SSCP、多重PVR、定量PCR等技术已成为目前进行分子诊断必不可少的技术。珠蛋白生成障碍性贫血的各种类型中以Bart胎儿水肿综合征最为严重，本病患者两条16号染色体上的4个。基因均有异常。用两段核苷酸PCO1，和PC02作为 基因的扩增引物；PCO3和PC04作为11号染色体上的 基因的扩增引物并以此为内参照。从羊水细胞中提取DNA，以PCR法扩增，经2030个周期后，将扩增样品电泳、染色后即可作诊断。,4FISH技术 FISH技术即荧光原位杂交速、简便、灵敏等优点。尤其是与传统的染色体技术比较更易检出易位、倒位、微小缺失等异常。FISH技术还可以作为肿瘤的辅助诊断方法。,5生物芯片 生物芯片的发展将是分子诊断的一次重要革命。DNA芯片又称DNA微列阵，它利用徼点阵技术，将探针(通常是DNA或cDNA)以高密度点阵的形式按一定的顺序固定排列在1 cm2的硅片(玻片、尼龙膜等)表面上，再将所研究的样本材料如DNA、RNA或cDNA用荧光标记，在芯片上与探针杂交；然后通应用于染色体病诊断和产前诊断，具有过激光共聚焦显微镜等对芯片进行扫描，井配合计算机系统进行分析，从而快速、准确地得出所需信息。,DNA芯片将生命科学研究中的许多不连续的分析过程，如样品制备、化学反应和分离检测等，移植到芯片中并使其连续化和微型化。为快速检测病原体和疾病组织中的突变序列提供了手段，并可实现高通量、大规模的操作。,目前已研制出用于检测HIV基因、囊性纤维性变相关基因、P53基因、乳腺癌相关基因等20多种基因芯片。例如已有人用有96000个核苷酸探针的芯片，成功检调出乳腺癌和卵巢癌基因BRCA-1第11外显子上的24个杂合突变。,三、分子诊断技术的应用 目前已经能够进行分子诊断的疾病包括如下几种。 1染色体疾病的诊断和产前筛查 染色体疾病包括染色体数目异常和结构畸变。目前已发现的人类染色体疾病约10000多种，已确定或已描述过的综合征约100多种。例如最常见的染色体疾病Down综合征(在新生儿中的发病率约为1/6001/800)、神经管缺陷症以及性腺发育不全等多种染色体异常造成的先天性缺陷。,染色体疾病可在光学显微镜下观察和识别，而特异的FISH诊断技术已成型、成熟。不仅可以进行染色体诊断，还可以进行产前筛查，指导优生优育。,2单基因疾病的分子诊断和产前诊断 单基因疾病由单个基因发生突变引起的遗传性疾病。已发现的人类单基因病多达400种以上。迄今，已经了解许多单基因疾病的致病基因以及发病机制，例如苯丙酮尿症、G6PD缺乏症、肝豆状核变性(Wilson 病)、Huntington 舞蹈症、脆性X综合征、Marfan综合征、血友病A、血友病B、血红蛋白病、珠蛋白生成障碍性贫血、软骨发育不全、先天性肾上腺皮质增生症、糖原累积症、多囊肾、家族性高胆固醇血症、家族性单纯生长激素缺乏症、某些神经肌肉系统疾病(如进行性肌营养不良)、线粒体疾病(如Leber视神经萎缩)等。,对于单基因疾病，诊断越早、治疗越早，则预后越好。例如一旦筛查确诊为苯丙酮尿症患儿，即应喂苯丙氨酸含量低的奶粉，进行饮食控制疗法，可防止智力受损，甚至智力发育可达正常水平。而有些单基因疾病属于X性染色体连锁遗传方式，具有性别遗传的特点，或只传男或只传女，因此通过产前诊断进行性别选择，可以达到优生优育的目的，解除患者的切身痛苦。,3多基因疾病的分子诊断 多基因疾病是大面积危害人群健康的多发病、常见病，如恶性肿瘤、心血管类疾病(动脉粥样硬化、高血压等)、糖尿病、神经系统疾病(早老性痴呆、重症肌无力等)、精神-心理疾病(精神分裂症、抑郁症等)、白血病、哮喘、自身免疫性疾病(系统红斑狼疮、类风湿关节炎、白塞病等)、近视眼等。,这些疾病的分子病因十分复杂，大多尚未找到疾病易感基因，可采用已知基因标志(geneic marker)的连锁分析和关联分析方法，对疾病进行亚型的基因分型和鉴定等辅助诊断，以利于疾病的正确治疗。,4感染性疾病的分于诊断 近年来，感染性疾病如伤寒和副伤寒、痢疾、结核、流行性出血热、病毒性肝炎、细菌性食物中毒、败血症、性病以及艾滋病(AIDS)等的发病日益上升。感染性疾病的诊断目前主要依靠病原学及免疫学检测，但由于抗生素的广泛应用，细菌感染性疾病的病原学及免疫学检测的敏感性受到一定影响，使得感染性疾病的诊断受到限制。,特别是结核杆菌、幽门螺杆菌、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、人类乳头瘤病毒、汉坦病毒感染的诊断问题尤为突出。分子诊断技术具有快速、准确、特异性高、敏感性强等特点，不仅可以对感染性疾病的病原体进行定性，而且可以定量。,目前可以开展分子诊断的感染性疾病病原体主要有结核杆菌(引起结核病)、幽门螺杆菌(与消化性溃疡、胃癌的发生密切有关)、乙型肝炎病毒(引起乙型病毒性肝炎)、丙型肝炎病毒(引起丙型病毒性肝炎)、庚型肝炎病毒(引起庚型病毒性肝炎)、人乳头瘤病毒(主要引起尖锐性湿疣等，其中某些型别可能与宫颈癌的发生密切有关)、,汉坦病毒(引起流行性出血热)、类风湿因子(用于辅助诊断类风湿性关节炎)、c反应蛋白(为肺炎球菌的c多糖物质，在急性炎症时增加，主要用于辅助诊断活动性风湿热等)、淋球菌(引起淋病，其中性病淋巴肉芽肿亚种主要引起化脓性淋巴结炎和慢性淋巴肉芽肿)、沙眼衣原体(引起沙眼)、梅毒螺旋体(引起梅毒)、生殖器支原体(引起泌尿生殖系感染与不育)、单纯疱疹病毒(其中HSV-2主要引起原发性生殖器疱疹)、,人类嗜T细胞病毒(可引起T细胞白血病)、EB病毒(可能与儿童恶性淋巴瘤、鼻咽癌的发生有密切关系)、巨细胞病毒(孕妇早期子宫内感染可引起死胎、早产和先天畸形)、水痘-带状疱疹病毒(可引起水痘、带状疱疹，孕妇患水痘可引起胎儿畸形、流产和死胎)、卡氏肺囊虫(主要引起AIDS的继发感染)、嗜肺军团菌(引起呼吸道感染)、腺病毒(引起呼吸道、眼结膜或胃肠感染)、伯氏疏螺旋体(引起莱姆病)、阴道毛清虫(引起滴虫性阴道炎)、疟原虫(引起疟疾)、HIV(引起AIDS)。,对上述感染性疾病病原体基因的检测，主要采用PCR结合ELISA的方法，以降低特异性差及PCR污染带来的误诊问题。,5恶性肿瘤的分子诊断 目前肿瘤的治愈率仍不高，主要原因就是早期诊断及正确选择化疗药物敏感性存在较大困难。造成到医院确诊的癌症患者，85%属晚期，70%以上已有远处转移。因而，肿瘤的早期发现和诊断对肿瘤的预防和治疗至关重要。,肿瘤标志在诊断肿瘤、检测肿瘤复发与转移、判断疗效和预后以及人群普查等方面都有较大的实用价值。 肿瘤标志可分为基因标志和基因表型标志，基因标志是指基因本身突变和表达异常，能反映癌前启动阶段的变化；基因表型标志是指基因产物表达和调控异常，表现为其所编码的表达产物合成紊乱，产生胚胎性抗原、异位蛋白，一般出现较晚。,因此，寻找特异性肿瘤基因标志进行肿瘤基因诊断，对于肿瘤早期发现具有重要意义，并可在患者临床症状出现以前预测肿瘤的易感性。,通过检测AFP、CEA、CA、abl、AFC、ras、myc、p53、p16、bcl2、BRCA1、BRCA2、c-erbB2、MMR、KALI、微卫星DNA不稳定性、LOH等肿瘤标志或癌基因、抑癌基因的变化，可以为肿瘤患者提供一个可靠的诊断指标。 例如导致女性的“第一杀手”乳腺痛，在乳腺癌大家系中2/3的患者身上可检测到BRCAl和BRCA2基因。,四、疾病分子诊断的展望 任何疾病的发生都是遗传物质和环境因素相互作用的结果。人类疾病基因和相关基因的定位、分离和克隆为现代医学带来了空前的机遇。一般而言，某一致病基因被发现后，几个月内即可用于诊断，而疾病相关基因可能也只需要2-3年就可被用于评估患病风险。疾病基因突变谱尤其是SNP图谱的建立，势必为分子诊断提供强有力的工具。,未来的分子诊断将朝着3个主要方向发展： 胚胎着床前诊断：在囊胚8个细胞期，通过对细胞的染色体核型分析和原位杂交，从而将人类的遗传缺陷控制在最早期阶段； 母体外周血中胎儿细胞分析技术：通过检测母体外周血中胎儿细胞而非通过羊膜穿刺或采集绒毛进行产前诊断，是一种非常有潜力的无创伤产前诊断方法；,对常见病、多发病如心血管系统疾病、糖尿病、精神疾病、神经系统疾病、恶性肿瘤、哮喘、近视眼等进行准确的分子诊断。,遗传性疾病除给患者本人带来痛苦外，还造成家庭与社会的巨大负担。虽然目前大多数遗传病没有有效的治疗方法，但若能得到及时诊断，根据该病的遗传方式、再发风险、有无产前诊断的方法，就有可能防止再生一个患类似疾病的孩子。,总之，随着后基因组学的深入和分子诊断技术的不断更新，特别是与其他学科如胚胎学、妇产科学、生殖生理学和仪器分析技术等的相互交叉和渗透，分子诊断将朝着高效、准确、灵敏和无创伤的方向发展。,分子诊断主要存在的问题，是其准确性、稳定性和复杂性。 以女性常见的乳腺癌为例，1996年美国的Myriad Genetics公司向市场推出了检测乳腺癌易感基因BRCAl和BRCA2携带者的试剂盒BRAC Analysis，深受欢迎。但实践发现这种预测并非万无一失。研究表明，携带乳腺癌基因并有家族史的女性，罹患乳腺癌的风险最多只有50%，而不是通常认为的85%。,预测医学固然为疾病的早期预防提供了便利，但同时也可能带来一系列伦理、法律和社会学问题。,首先，由于基因检测能很容易地推定一个胎儿是否含有某种缺陷基因，且这种基因将有可能使胎儿在某个年龄段比如少年时代夭折，那么，胎儿的父母和其他家庭将做何选择?顾念骨肉深情坚持保留，是人类的本能和传统的选择，但基因检测的“死亡之约”又使人能预见未来的“丧子之痛”。,其次，基因歧视(genetic discrimination)，基因图的公开和共享将使个人的基因信息因此成为像身份证之类的个人信息之一。但对于被检测出存在有基因缺陷的人，有可能受到来自各方面的歧视(就业、恋爱、婚姻、保险等)。,最后，传统上患者的医疗信息仅限于患者和医师之间，于其他人无关。但将来如果基因检测出患者患有某种遗传性疾病，那么医师将如何处置?告诉患者正打算怀孕或已经怀孕的妻子或姐妹他们的后代将同样有这样的遗传病?把这种不祥信息通告给患者所有的家庭成员，使他们的心灵乌云密布、生活上手足无措?同时，西方天主教思想中的激烈反节育和反堕胎的教义将受到必然的全面的冲击。,第二节 感染性疾病的分子诊断,一、感染性疾病基因诊断的策略 感染性疾病是由于感染了某种病原体而引起的一类疾病。过去对这类疾病的病因诊断是通过检测病原体的形态或通过病原体的培养观察其生态、生化特性以及毒性试验等，或检测病人体内特异性抗体等方法作出判断。这些方法存在较大缺陷。,病原体都是生物体，每种生物都有各自种族特异的基因。DNA重组技术的发展，对多种病原体的基因作了大量的分析工作，对常见病原体的特异基因或DNA片段的组成特点积累了大量的资料。,采用核酸分子杂交技术，针对病原体特异的核酸序列设计探针来进行杂交； 应用PCR技术扩增病原体基因的保守序列； 将核酸分子杂交技术与PCR技术联合应用，能够对大多数感染性疾病作出明确的病原体诊断，而且能诊断出带菌者和潜在性感染，并能对病原体进行分类、分型鉴定。,二、病毒性肝炎的基因诊断 (一)肝炎病毒基因中可用于基因诊断的序列 甲型肝炎病毒 甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)只有一个血清型，其基因组为线状、单股正链RNA分子，仅含一个开放阅读框，迄今已有几株甲肝病毒基因全序列得到克隆，如HMl75, MBB, LA等。,以HMl75序列为例，甲肝病毒基因的结构可表示为：5-非编码区（noncoding region, NCR)-p1区-P2区-P3区-3-NCR-多聚腺苷尾。其中P1编码病毒核壳蛋白，P2是转录及基因调节区；P3区编码非结构蛋白。而5-NCR是HAV基因组中最保守的部分，各病毒株间核苷酸序列的一致性达96%97%。全长734bp。3-NCR约为60bp，也相对较保守。,2乙型肝炎病毒 乙型肝炎病毒(HBV)基因组包含4个开放阅读框(ORF)，分别为S、C、P和X区。C区编码IBV的HBcAg，变异性较小，是HBV基因中较为保守的区段，是扩增的最佳部位。S区、P区和X区中亦有较保守的序列，可作为靶序列进行扩增。,3丙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒(HCV)基因组为单股正链RNA，基因组由5-NCR、开放阅读框(ORF)和3-NCR组成。其中ORF包括靠近5端的结构基因区，该区内含有核心蛋白基因(C)、包膜蛋白基因(E1)，以及靠近3端的非结构基因区（NS1/E2，NS2-NS5)。,在HCV RNA基因组中，5-NCR长322个核苷酸。该区是HCV基因组中最保守的区域，在不同病毒分离株间，最多只有8%的核苷酸发生改变。核心蛋白基因区(C区)的保守性也较高，仅次于5-NCR；此外，非结构基因区部分序列也具有相对保守的序列；3-NCR是变异性最大的区域，具有一个polyu片段尾，此结构为HCV所特有；而包膜蛋白基因区(E1)的变异性较大。,4丁型肝炎病毒 丁型肝炎病毒(HDV)基因组为共价闭合的单股负链RNA，全长为1678个核苷酸，是已知动物病毒中最短小的。RNA中G、C含量高，约占60%，且含有多个集中保守序列。这种RNA分子的另一特征是具有次级结构，像一种双链棒状RNA，还有它的二聚体及三聚体，它们可能是复制的中间体。利用单链探针证明确实存在基因组全长单体和墓因组二聚体及反义基因组二聚体(反义基因组二聚体占优势)。,5戊型肝炎病毒 戊型肝炎病毒(HEV)基因组为单股正链RNA，具有3个开放阅读框，其中第2、第3开放阅读框中部分序列高度保守。,(二)病毒性肝炎的基因诊断 1PCR方法 (1)引物设计： 引物是PCR扩增的关键，决定着扩增的特异性和敏感度。一般根据肝炎病毒基因的保守区来设计引物。,如HBV的检测可根据其C、S、P、X基因中的高度保守区来设计引物；检测HCV则通常用5-NCR区设计的引物来扩增，该区引物的阳性检出率达90%。HDV RNA易形成二级结构，会影响扩增效率，可用较高温度破坏RNA的二级结构，并在一定温度下进行逆转录，同时，所应用的PCR引物最好是根据ORF 5区3端的序列来设计。,(2)方法选择： 除HBV外，HAV、HCV、HDV、HEV都是RNA病毒，所以采用RT-PCR方法(即先将RNA逆转录成cDNA后再作PCR)进行检测；为提高检测的灵敏度可采用巢式PCR方法。为定量检测HCV RNA，也可采用竞争性PCR和分支DNA(branched DNA，bDNA)检测法。,(3)扩增产物分析： 常用琼脂糖凝胶电泳来分析扩增产物。为提高特异性或灵敏度，可用限制酶酶谱分析法、点杂交法、Southern印迹法等方法进行分析。,2核酸分子杂交法 利用分子杂交直接检测病毒RNA也是一种较为特异敏感的方法，但不如PCR法灵敏。可采用与病毒RNA互补的cDNA探针进行斑点杂交来直接检测血清中的病毒基因组。,3DNA芯片技术 采用合适的策略，制备各型肝炎病毒的基因探针，固化在支持物上制成肝炎基因芯片。通过一次杂交即可对各型肝炎进行筛查，且可同时分析大量的样品，对疾病作出早期诊断、分型诊断。这是一种崭新的方法。,三、细菌性疾病的基因诊断 应用经典的微生物学方法检测致病菌，费时、费力，操作繁琐。样品中靶细菌数较少，或者受到其它杂菌竞争性抑制时，往往使检出结果或效率受到影响，这对于细菌性疾病的防治及预后有不利影响。,基因诊断方法的应用使细菌性疾病的诊断发生子一个质的飞跃。不同种属细菌基因组DNA具有特异的DNA序列，以区别于别种生物体的DNA序列。近年来广泛应用PCR技术对细菌引起的疾病进行基因诊断。PCR技术仅需极微量(510个细菌)的DNA作为模板，对样品处理要求简单，因而这一技术为临床许多细菌性疾病的防治和预后评价提供了更为有效的手段。下面以细菌性痢疾和霍乱为例介绍细菌性疾病的基因诊断。,（一）细菌性痢疾的基因诊断 细菌性痢疾是一种古老的肠道传染病，病原体除4种痢疾杆菌外，还包括若干血清型的侵袭性大肠杆菌(cnteroinvasive E coli, EIEC)。这两种细菌虽为不同菌属，但在遗传学上存在着高度的亲绿关系和相同的致病特征。它们均能穿入肠亡皮细胞，定居繁殖，产生痢疾综合征。,长期以来，传统的分离培养、血清学试验、生化反应等常规方法，在菌痢病原体诊断中发挥了良好的作用。但一般需要23天时间。其中EIEC的鉴别仍需要通过豚鼠眼结摸试验或HeLa细胞穿入试验才能获得明确的结果。,所有的痢疾杆菌和EIEC通常均携带一个侵袭必需的非结合型大质粒。该质粒能编码多种侵袭相关外膜蛋白，是产生痢疾综合征的重要致病因子。目前至少已从该质粒上 一个2.5kb侵袭相关区段中设计出两对能特异检测所有痢疾病原菌的PCR引物。,其中 一对位于侵袭相关基因座位(ial)上， 引物1为：5-CGGGTAGGTATGGTGAGG-3； 引物2为：5-CCAGGCCAACAATTATTTCC-3； 其扩增片段长320bp。,为验证扩增产物的特异性，可用32P 等标记的寡核苷酸探针(5-CCATCTATTAGAATACCTGTG-3)通过Southcrn印迹杂交进行鉴定。另一对引物的扩增产物包含一个开放阅读框的绝大部分，这个开放阅读框从nt 108开始到nt 737结束。选择的5引物KL1从nt 149开始，长度为18个核苷酸，5-TAATACTCCTGAACGGCG-3;3引物KL8从nt 897开始，长度为19个核苷酸，5-TTAGGTGTCGGCTTTTCTG-3，其扩增产物长760bp。用Acc I和Pst I双酶切2.5kb)片段(已被克隆)所产生的一个210bp次级片段作为探针，通过Southern印迹杂交鉴定扩增特异性。,以上两对引物经实验均显示了较好的特异性，但由于其扩增区域存在较高的自然缺失突变频率，故常可出现假阴性结果。为了克服这种影响，可以从另外一些毒力相关基因序列中设计引物。研究证明，大质粒上编码侵袭质粒抗原H(ipaH)的基因为多拷贝，而且染色体基因组中也携带其同源序列。,已经从多拷贝ipaH基因同源区设计出一对能扩增498bp片段的引物。这对引物经试验不仅能与纯化的大质粒反应，而且也能以纯化的染色体DNA作模板，扩增特异片段，因而可避免大质粒丢失或缺失突变的影响，在菌痢病原体的诊断中具有特殊的应用价值。,(二)霍乱弧菌CT操纵子的PCR检测 霍乱肠毒素(cholera enterotoxin，CT)是01群霍乱弧菌的主要毒力因子。然而，环境中分离的大量霍乱弧菌01菌株不产生CT，也无产生CT的潜能，而一些非01霍乱弧茵却能产生CT，这样对分离的霍乱弧菌必须检查其能否产生CT以评价其临床意义。Shirai等建立了检查CT操纵子(ctx)的PCR方法井将其成功地用于检测粪便标本。,设计的引物及其相应于CT操纵子的位置如下 引物1 5 CTCAGACGGATTTGTTAGGCACG-3，711735位； 引物2 3-GCATTATCCCC-GATGTCTCTATCT-5，9901013位。 扩增产物(302bp)用5%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，并用合成的与扩增序列特异的寡核苷酸探针进行Southern印迹杂交。,探针序列为5-ACTATATTGTCTGGTCATTCTACT-3。引物1和2扩增序列的特异性好，敏感性高。PCR最低能检出110pg的模板DNA，扩增产物能与CT操纵子特异的32P标记的寡核苷酸探针杂交。通过对临床和环境中分离到的Ol群霍乱弧菌及其它相关菌试验表明，PCR法与多核苷酸探针检测结果一致，并且可用于直接检测腹泻病人的水样粪便。,四、寄生虫疾病的基因诊断 人类寄生虫疾病通常采用血涂片或其它被检物的光学显微镜检查及免疫学方法，可获得比较满意的结果。但是，光学显微镜检查费时费力，难以胜任现场大量标本检测的要求，有时也可能发生漏检。用免疫学方法检查抗体，虽然较灵敏，但不能鉴别是既往感染还是现行感染(因为原虫消失后其抗体仍可继续存在)，这对制定治疗方案及预后判断不利。,一种寄生虫疾病能否采用DNA诊断，取决于两个基本前提： 在寄生虫基因组DNA中具有特异的DNA序列； 能根据这种特异的DNA序列制备具有特定信号的探针或设计特异引物进行PCR扩增。 从目前情况来看，不少种类寄生虫具备以上两个基本的前提。此外，由于操作方法上的发展与改进，DNA诊断已能在现场大规模推广应用。下面以疟疾为例介绍寄生虫病的基因诊断。,疟疾是严重的人类寄生虫疾病，目前可应用DNA探针(即分子杂交技术)和PCR技术来诊断疟疾。,1.DNA探针技术 疟疾基因诊断中常用的DNA探针有重复序列探针、寡核苷酸探针，基因组DNA探针及rRNA探针等。,(1)重复序列探针 目前各种疟原虫DNA文