布病检验技术及研.ppt

布病检验技术及研究,玉门市疾控中心,世卫组织建议的检测包括：,虎红平板试验(RBT) 血清凝集试验(SAT) Coombs试验 补体结合试验(CFT) ELISA 荧光偏振 布氏菌培养 PCR 世卫组织未具体确定流程、取舍值和检测特征（诊断灵敏性和特异性） 没有明确的阳性和阴性预测值（PPV & NPV） 结论 取舍值（及灵敏性/特异性）因抗原来源和流程差异而不同，有待优化 PPV和NPV取决于疾病的流行程度，有待确立 建议 开展检测前，应在设计适当的环境中确定诊断功效（灵敏性、特异性、PPV和NPV等）,实验室检查方法,（一） 外周血象 白细胞计数正常或偏低。 淋巴细胞相对或绝对增加，可出现少数异型淋巴细胞。 血沉在急性期加快，慢性期则正常或偏高，持续增速提示有活动性。 （二） 病原学检查 取血液、骨髓、组织、脑脊液等做细菌培养，急性期培养阳性率高。,（三） 免疫学检查 平板凝集试验 虎红平板（RBPT）或平板凝集试验（PAT）结果为阳性，用于初筛。 试管凝集试验（SAT） 用于确诊。 补体结合试验（CFT） 滴度1：10 +及以上。 布鲁氏菌病抗-人免疫球蛋白试验（Coombs） 滴度1：400 +及以上。,一、虎红平板凝集试验（RBPT）,原理：虎红平板凝集试验(RBPT)中所用的抗原是酸化性（PH=3.6-3.9）带色抗原，与被检血清作用时能抑制血清中IgM类抗体凝集活性，检查出的抗体是IgG类。 目的、对布病的诊断意义 排除某些非特异性凝集及某些其它细菌共同抗原与抗布氏菌血清出现的交叉反应，是一种快速、简便而有效的实验。该法多用于大规模筛选。,样品（标本）采集要求及采样量 用灭菌注射器无菌操作采取静脉血5ml置于无菌一次性采血管内(不加任何抗凝剂的空管采血3-5ml)，置斜面，分离血清。 所需试剂、仪器设备、试验环境条件 清洁脱脂玻片或凹形孔的玻片、1ml吸管或微量加样器、微型玻璃搅棒（可用牙签替代）、虎红平板凝集抗原、被检血清。 操作步骤 在玻片上加0.04ml被检血清，然后加入虎红平板抗原0.04ml，摇匀或用玻璃搅棒混匀，在5min内判定结果。,质量控制 所用器材洁净，试剂标准，并在有效期内使用，所加剂量必须准确。血清标本不得发生溶血 结果判定 在5min内出现可见的凝集现象为阳性反应无凝集现象出现为阴性。 工作时限要求 个案病例，送检材料2日内完成，大批量样本不得超过7日。如全血不能及时分离血清，可冷藏4C保存，但保存期不得超过3日。血清可冷冻保存，保存期不得超过2月。,优点：简便、快速、易掌握，敏感性较好；可作为筛查试验；经济、方便。 注意事项： 1）观察结果在自然光状态下。 2）混合液体面积尽量大，使得抗原和 血清中抗体充分反应。,二、试管凝集试验（SAT）,原理：SAT是一种特异、较敏感、稳定的检测方法，可以检测人、畜血清中的抗布鲁氏菌IgG、IgM、IgA 3类免疫球蛋白，且SAT检测IgM的敏感性较高，因此可作为布鲁氏菌病的早期诊断，同时又可用于布鲁氏菌病疫苗免疫后血清抗体的检测。 应用：试管凝集试验（SAT）的应用已有近百年历史，国内外成功地应用到人、畜间布鲁氏菌病的诊断上。实践证明该试验时一种简便异形，有一定特异性和敏感性的布病诊断方法。SAT试验操作简便，判定容易，因此有广阔的应用前景。 检测IgM的敏感性较高。（布病主要产生IgM、IgG两种抗体）,样品（标本）采集要求及采样量 用灭菌注射器无菌操作抽取静脉血5ml、3000转/分离心15min分离血清备检。 试剂及器材 试管凝集抗原、被检血清、阳性血清、稀释液（0.9%生理盐水） ；1ml、 10ml 吸管、试管架、37 温箱、离心机等,操作步骤,实验前的准备,1、试管的准备 把试管浸泡于带有洗涤剂的温水中30分钟，浸泡后用试管刷将其刷干净。先用自来水冲洗10遍，再用去离子水冲洗1遍。 试管冲洗干净后倒置于篮子中，等水沥干后置干燥箱中，160干燥3个小时（整个干燥过程需要56个小时）。 实验前要配置0.5%的石炭酸生理盐水 配置方法：称取0.5克石炭酸，加入100ml的生理盐水中，配置后置高压锅中121高压30分钟。 2、试剂的准备 标准抗原:按照说明书使用。使用时充分摇匀，用稀释液作1：20(工作浓度)稀释。,标准阳性血清冻干品，使用前用蒸馏水溶解至规定容积。 标准阴性血清:冻干品，使用前用蒸馏水溶解至规定容积。 3、被检血清 按常规方法采血分离血清 血清必须新鲜，无明显蛋白絮凝物、无溶血和无腐败气味。 运送和保存血清样品 防止血清冻结和受热，以免影响凝集价。若3d内不能送到实验室，可用冷藏方法运送血清。,抗原的稀释：将试管凝集抗原充分混匀后， 用0.9%生理盐水做10倍稀释，备用。 标准比浊管的制备：为了判定结果准确，应制备凝集反应标准比浊管，作为判定透明程度的依据，其配制方法如下：取凝集反应稀释后的抗原液再作对倍稀释，即2ml稀释抗原再加2ml盐水，混合后按下表配制。,“+”液体完全透明，菌体呈伞状沉淀或块状颗粒状沉淀，呈100%凝集； “+” 液体近于完全透明，菌体呈伞状沉淀，呈75%凝集； “+” 液体略微透明，菌体呈较薄伞状沉淀，呈50%凝集； “+” 液体不透明，管底有不很明显的伞状沉淀，呈25%凝集； “-” 液体不透明，无伞状沉淀。 注：效价：以产生 50%凝集的(+凝集程度)血清最高稀释倍数为受检血清的效价。,被检血清： 1、每份血清取9支小试管，放于试管架上。 2、血清稀释：第一只管加生理盐水2.4ml，第二只不加，第三只到第九只管各加0.5ml盐水。然后用1ml吸管取被检血清0.1ml加入第一管中，混匀后吸1ml加入第二、三管各0.5ml，第三管混匀后再吸0.5ml加入第四管，以此类推到第八管吸0.5ml弃掉。,3、加入抗原：取出之前稀释好的试管凝集抗原，然后从第二管开始每管加入0.5ml，加入抗原之后，血清的最终稀释倍数为从第二管开始1：50、1：100、1：200、1：4001:1600，第一管为血清对照。然后充分混匀，放于37温箱中18-20小时后取出，在室温下放置1-2个小时观察结果。 阳性对照：加入1ml的生理盐水使其溶解（充分溶解使阳性血清的效价发挥到最大），稀释、加入抗原（方法、步骤同被检血清样本的操作）。,结果判定： 1、人血清中滴度为1：50()判定为可疑，滴度为1:100（+）及以上滴度判定为阳性。 2、牛、马、鹿、骆驼等大型动物血清滴度为1：100(+)及以上者判定为阳性，滴定为1：50()为可疑。 3、猪、羊(绵羊、山羊)、犬等小家畜血清滴度为1：50(+)及以上者判定为阳性，滴定为1：25()判定为可疑。 对可疑反应的人和动物应在10-25天内重复检查，复查时主要结合流行病学和临床表现而定，流行病学不成立者不必复查，复查主要目的是便于进一步确定诊断。,出现前带现象的原因分析： 做凝集反应实验时，有个别血清会出现前带现象，比喻为“本来是前面清亮，后面浑浊，而出现前面浑浊，后面清亮现象”即稀释度低的血清管内（或血清量多的管）不发生凝集，而稀释度高的管内（或血清量少的管）出现凝集，这叫做前带现象。如果某血清在虎红平板凝集反应中出现了前带现象，那么做试管凝集反应时应多做几个管，多采用几个不同的稀释度进行判定。,胶体粒子学说：血清稀释度低所含的胶体粒子多，它影响抗原抗体的结合，而稀释度高的则含胶体粒子少，所以出现凝集。 不完全抗体学说：血清中因存在不完全抗体竞争抗原，所以在低稀释度的管中不凝集。 抗原抗体比例失调，也就是抗体过剩或血清内含有过多防腐剂，严重污染可造成前带现象的产生，封闭抗原的干扰。 抗原抗体比例失调，也就是抗体过剩或血清内含有过多防腐剂，严重污染可造成前带现象的产生，封闭抗原的干扰。,影响试验结果的因素及注意事项： 1、受检血清应新鲜、无溶血、无污染，存放血清处温度不能超过10，采血后应于34日内进行检查，因放置时 间过长可能会导致血清效价降低。 2、遵守操作规程：所用的器材要清洁、干燥，试剂的加量一定要正确，放入温箱的温度和时间都要按要求，否则都影响结果。 3、血清或抗原中含有过多的防腐剂，阻止或妨碍了抗原的凝集。,4、血清在进行灭活处理时，温度过高会使血清中的少量胶原蛋白出现凝固作用，使抗原与抗体无法充分结合，影响结果判定。 5、氯化钠的含量增高对血清反应有明显的影响，盐的浓度越高，反应的敏感性提高，因此在兽医界为了克服凝集反应中的阻抑抗体的干扰，对羊血清采用高渗盐水作凝集反应，一般浓度在1012%，切记人血清不能用高渗盐水（ 10% ）。,试管凝集实验的评价： 简便、易操作，适用于各实验室应用。 特异性较好，敏感性也高，因此适用于检疫和临床诊断。 有材料报道，人感染布氏菌后常于发烧的第一天起就