《生药学》理化鉴定.ppt

理化鉴定,理化鉴定(physical and chemicalidentification) 利用某些物理的、化学的或仪器分析方法，对生药中所含有效成分或主要成分或特征性成分进行定性和定量分析，以鉴定其真伪和品质优良度的一种方法。,理化鉴定,中药理化鉴定发展很快，新的分析手段和方法不断出现。 可确定中药的真伪优劣； 开发利用新资源； 指导中药材的栽培加工，扩大药用部分； 制订中药质量标准。 发展方向：从宏观和微观的形态学鉴定向有效成分和药效鉴定方向发展。,常用的理化鉴定方法,化学定性反应 微量升华 荧光分析 色谱法 纸色谱与薄层色谱(PC&TLC) 气相色谱（GC) 高效液相色谱(HPLC) 电泳法 光谱法,定义,方法,直接将生药切片或粉末置载 玻片上，滴加试液，加盖玻 片在显微镜下观察产生的结 晶、沉淀或颜色。,生药的提取物置载玻片上， 滴加试液，加盖玻片在显微 镜下观察反应。,显微化学定位,一、 化学定性反应 1.显微化学反应,2.沉淀反应： 利用生药某些化学成分能与某些试剂产生特殊的沉淀反应来鉴别。 3.泡沫反应和溶血指数的测定,二、微量升华 利用中药中所含的某些化学成分，在一定温度下能升华的性质，获得升华物，在显微镜下观察其结晶形状、颜色及化学反应作为鉴别特征。,一、微量升华的原理及方法,二、在鉴定中的应用,三、荧光分析 利用生药中所含的某些化学成分，在紫外光或自然光下能产生一定颜色的荧光性质进行鉴别。 例如 黄连饮片显黄色荧光； 浙贝母粉末显亮淡绿色荧光； 大黄粉末显深棕色荧光。,荧光效率主要与物质的结构有关，具有-共轭结构的物质才能产生较强的荧光，共轭结构加长，荧光增强。 含有黄酮、恩醌、香豆素、木脂素成分的生药，一般具有较强的荧光反应。,荧光分析法在生药鉴定中的应用,定性分析,紫外分析仪法,1、观察生药整体 2、观察生药的新鲜断面或饮片 3、观察生药粉末 4、直接观察生药的某种溶剂浸 出液 5、将生药提取液滴于滤纸上， 挥干溶剂观察 6、生药提取液与化学试剂作用 后产生荧光 7、多重观察,日光法,荧光显微镜法,荧光光谱法,定量分析：荧光分光光度法、薄层荧光扫描法,四、色谱法 常用以下三种色谱法： 薄层色谱法(TLC) 气相色谱法(GC) 高效液相色谱法(HPLC),薄层色谱,操作：选择吸附剂 制备薄层板 点样 定性参数的选测定 显色 展开 （比移值Rf、相对比移值Rst）,应用：定性分析 定量分析,以Rf做定性的依据，因影响Rf因素多，需用标准 对照品作对照。在两种或两种以上展开系统种展开， 若样品中斑点的Rf值与标准对照品的Rf值匀相同可基 本肯定二者为同一化合物。,定性鉴别,用标准物质对照别,标准 对照品,对照药材,用相对比移值鉴别,用文字描述鉴别,原点中心至斑点中心的距离 Rst = 原点中心至参考物质斑点中心的距离,定量鉴别,分两类： 一是将待测物从薄层板洗拖后，选择适宜的方法测定（洗脱法）； 二是薄层展开后，用薄层扫描仪在薄层板上测定被分离组分的含量（薄层扫描法）。,洗脱法分四步进行： 待测组分的分离 斑点定位 斑点的收集及洗脱 测定（多采用UV及可见光分光度法）,薄层扫描法： 波长的选择（样品波长、参比波长） 测定方式的确立（透射、反射、荧光） 扫描方式（直线式、锯齿式） 标准曲线线性化（与散射参数有关，硅胶薄层板SX=3，氧化铝薄层板SX=7） 定量前需考察的主要内容：工作曲线、精密度、准确度 测定方法：外标一点法，外标二点法。,HPLC 可用于定性和定量，色谱图中各色谱峰的保留时间、色谱峰相对百分峰面积及主要色谱峰的UV吸收光谱，均可作为生药真实性鉴定的指纹资料。 是生药及制剂质量分析常用的方法。,GC 主要用于含挥发性成分的定性和定量。用于鉴定的数据主要是保留时间、相对百分峰面积。常常和质谱联用，快速鉴定成分,五、电泳法,带电质点（分子、离子或胶体颗粒）在电场作用下，向着与其所带电荷相反的电极移动，称为电泳。 应用： 生物学和生物化学领域。 生药中主要用于氨基酸、多肽、蛋白质、核酸等。,分光光度法 紫外分光光度法 可见分光光度法 红外分光光谱法 原子吸收分光光度法,六、光谱法,一切物质都会对可见光及不可见光中的某些波长的光线产生吸收。不过其吸收的程度是不同的。即物质对不同波长的光线表现出不同的吸收能力，物质的这一特性称为选择吸收。 物质对光线的选择吸收反映了它们分子内部结构的差异。也就是说，通过研究物质得分子吸收光谱，就可以鉴别物质的分子结构。这是分光光度法对生药进行定性鉴别的依据。 物质吸收光子能量的强度，不仅取决于物质的分子结构，而且还与被光子所作用的物质的分子数目，即物质的浓度有关。这是分光光度法对生药进行定量鉴别的依据。,分光光度法在生药定性分析中的应用,原理：同种生药的光谱具有一定的稳定性及重现性 不同种类生药的光谱各不相同,方法：UV分光光度法,比较光谱的一致性（与对照药材比较； 与文献标准光谱核对） 比较导数光谱的一致性（用于UV光谱 不易区分） 比较光谱的特征吸收（常用特征数据： 最大吸收波长和吸光度比值）,电子光谱，辐射波长200-400 nm，仪器为UV分光光度计选 择性不如 IR。主要用于定量及物理常数测定,IR分光光度法 振转光谱，辐射波长2.5 - 15m。具特征峰多、专属性强 （特别是在 7-15m一段称指纹图谱，峰多且尖锐）、用试样量少 快速简便。用于生药真伪鉴别及结构鉴定。,方法：1、样品的处理：直接粉末法、溶剂提取法 2、制片：压片法、涂片法 3、光谱分析：不需要确定光谱中各主要吸收峰的归属， 只在4000-400cm 范围内比较光谱的差异。 A、在某一波数处，一方有明显吸收峰，另一方无。 B、在某一波数内，两吸收峰的形状强度有明显不同。 C、被鉴别双方在指纹区的特征不同。 上述三种，只要有其中一种就可做出鉴别结论。,-1,应用举例,物理常数,包括相对密度、旋光度、折光率、凝点、熔点等。对于油 脂类、挥发油类及树脂类药材的真实性和纯度鉴别具有特别重 要的意义。,相对密度 熔点,区别或检 查生药的 纯杂程度,区别或检 查生药的 纯杂程度 测定含量,折光率,区别不同 的油类或 检查生药 纯杂程度,旋光度、凝点,首选有效或活性成分，如含有多种活性成分，应尽可能选择与中医用药功能与主治相关成分 为了更全面控制质量，可以采用同一方法测定2个以上多成分含量，一般以总量计制订含量限度为宜 对于尚无法建立有效成分含量测定，或虽已建立含量测定，但所测定成分与功效相关性差或含量低的药材和饮片，而其有效成分类别又清楚的，可进行有效类别成分的测定，如总黄酮、总生物碱、总皂苷、总鞣质等的测定 含挥发油成分的，可测定挥发油含量 某些品种，除检测单一专属性成分外，还可测定其他类别成分，如五倍子测定没食子酸及鞣质；姜黄测定姜黄素及挥发油含量等 应选择测定原形成分，不宜选择测定水解成分 不宜采用无专属性的指标成分和微量成分（含量低于万分之二的成分）定量,含量测定成分的确定,DNA 分子鉴定,20世纪90年代中后期开始,解决形态鉴定的某些局限,同属多来源药材的鉴别,道地药材的鉴别等,特点：稳定性、多样性、化学稳定性 方法：RFLP、PCR、RAPD等 应用：植物分类、中药材鉴别、道地生药鉴定,Identification of TCM by DNA Molecular Marker,PCR-RFLP,DNA Chip,Diagnostic PCR,DNA分子遗传标记在生药鉴定中的应用,1在植物进化、分类、鉴定中的应用 应用分子遗传标记技术来研究种间、属间的DNA变异情况，从而揭示物种的亲缘关系，为物种鉴定及系统学研究提供依据。,采用RAPD分子标记方法比较4种甘草属植物光果甘草、乌拉尔甘草、刺甘草和刺果甘草的遗传关系。 通过DNA扩增的RAPD指纹图谱分析，结果发现富含甘草甜素的光果甘草和乌拉尔甘草之间遗传关系非常相近。,这两者与不含甘草甜素或含量极低的刺甘草和刺果甘草的遗传关系则较远，与植物分类学研究相吻合。,2在中药材鉴别中的应用 通常PCR扩增的模板DNA都来自新鲜的动植物组织材料，因DNA分子遗传标记方法用于生药鉴别中，首先要解决的问题是能否从干的或陈旧的生药样品中提得生药本身的DNA，并能用于PCR扩增，这方面已有成功的报道。,用RAPD方法对人参、三