艾滋病实验室检测.ppt

艾滋病实验室检测,平罗县妇幼保健所 徐秀琴,HIV抗体检测 实验室生物安全,二个方面,二、 HIV抗体检测,全国艾滋病检测技术规范 引用文件： 艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准 （中华人民共和国卫生行业标准，WS293-2008）,常规HIV抗体检测的方法,HIV抗体检测分为筛查试验（包括初筛和复检）和确证试验。 筛查试剂 必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂，其中酶联免疫试剂应批批检合格。推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。,HIV抗体检测要求,1. 实验室:经卫生行政部门考核、审评和批准后 2. 检测场所：符合全国艾滋病检测工作规范的要求； 3. 人员: 经国家或省级艾滋病抗体检测学习班培训; 4. 试剂: 批批检合格、进口许可证、生物制品检定所检定、 5. 保密: 初筛检测的阳性结果不是最终结果,必须经确证试验由 HIV抗体确证实验室出具阳性报告才具有法律效应,且须由卫生行政部门选择适当方式和时间通知其本人及其家属,不得向无关人员透露有关情况,感染者档案以机密形式专人负责管理; 6. 标本: 及时分离血清(浆)、无变质、无污染、无溶血。 7. 天气炎热、路途较远时应低温用带盖不易破损容器专人运送， 并详细填写送检单；城区24小时、农村48小时内送确证实验室,筛查样品和方法,样品：可采用血清、血浆、滤纸干血斑、唾液和尿液样品。 （人类免疫缺陷病毒抗体口腔黏膜渗出液诊断试剂 ） 方法 1.酶联免疫吸附试验（ELISA） 2.化学发光或免疫荧光试验 3.快速检测（RT）及其它检测试验 这类试验简便快速，适用于应急检测、门诊急诊检测。一般可在1030分钟内得出结果。 明胶颗粒凝集试验（PA） 免疫渗滤试验 免疫层析试验,酶联免疫吸附试验,酶联免疫吸附试验简称酶标法，是根据酶免疫测定原理发展的一种技术，目前已广泛用于各种抗原和抗体的检测，也是最常用的HIV抗体检测方法。 目前已推出第四代HIV抗体ELISA检测试剂，但其基本方法分三类：间接法、双抗原夹心法和抗原竞争法。,快速试剂的应用,偏远地区 急诊 临床（高危） 职业暴露 临产,HIV快速检测的优点,试剂稳定，室温长期存放 不需要大型设备 操作简便、迅速、肉眼可读 特异性、功效率基本与ELISA接近 适用于应急检测和个体检测,HIV快速的局限性,一般不用于血液筛查 有一定的假阳性反应 窗口期问题（假阴性）（小于3个月） 主观因素,HIV快速检测的注意事项,有关部门批准 有效的试剂 从事人员经过培训，上岗证 严格按试剂说明书操作 有效期使用，正确储存 18-25实验室环境下操作 严格按照试剂说明书的时间要求进行判读结果，不可早判或晚判 建立室内（间）质控体系，定期用质控血清对试剂进行检测，观察是否显色，显色时间，显色程度。,HIV快速检测的注意事项,条带的色深程度与标本中抗体的浓度不存在线性关系 阴性结果不排除有HIV感染的可能 出现阳性及可疑结果，还应用ELISA法及时复检并确证 判读结果双人核对 判读结果的环境需要光线充足,筛查程序,（1）初筛试验 根据检测目的选用符合要求的筛查试剂对样品进行初筛检测，对呈阴性反应的样品，可出具HIV抗体阴性（-）报告；对呈阳性反应的样品，需要进一步做复检试验和确证试验。 （2）复检试验 对初筛呈阳性反应的样品，应使用原有试剂和另外一种不同原理（或厂家）的试剂，或另外两种不同原理或不同厂家的试剂进行复检试验。如果初筛检测使用抗原抗体联合试剂，则复检必须包括一种抗原抗体联合试剂。如两种试剂复检均呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性（-）；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确证实验室进行确证试验（图1）。如果抗原抗体联合试剂检测呈阳性反应，而抗体试剂检测为阴性反应，则应考虑进行HIV-1 p24抗原或核酸检测，必要时进行随访。 艾滋病检测筛查实验室复检判定为阳性反应的样品，确证实验室可以直接进行确证试验。,HIV,HIV抗体初筛检测的局限性,1. 阳性反应样本不能确证，需用本法和其它方法复检，如仍为阳性，需确证试剂进一步确证。 2. 阴性结果不能排除HIV感染：HIV感染后血清阳转前的“窗口期”，HIV抗体检测为阴性，晚期艾滋病患者某些抗体（如P24等）可能检测不到。 3. 可能出现假阳性或假阴性结果：了解试剂供应商因其使用抗原和包被方法技术存在一定差异。 4.不能诊断18月龄新生儿的母婴垂直感染。,筛查试验结果的报告,筛查试验（-） 出具“HIV抗体阴性”报告 筛查试验（+） 出具“HIV抗体待复查”，不能出阳性报告 筛查试验呈阳性反应样品的转送 如需送上级实验室进行复检，需要核对身份，补充个人信息（如姓名和身份证号码），必要时采集第二份血样，持HIV抗体筛查报告，送当地艾滋病筛查中心实验室，或直接送确证实验室复检。 两次检测均阳性或一阴一阳报告为 “HIV抗体待确证”； 两次检测均阴性报告为“HIV抗体阴性（-）”。 HIV抗体复检报告需由1名检验人员和1名审核人员签字。,初筛检测中值得注意的几个问题(1),1、初筛检测的阳性结果不是最终结论，不能通知受检者及其他人员，阳性样本需用该试剂和另一种试剂复检，如仍为阳性，应及时送HIV抗体确证试验室用确证试验检测； 2、初筛检测的宗旨是要尽可能检出所有的阳性样本，因此应选用敏感性高的试剂，且必须为HIV-1/2混合型，使用不符合规定的试剂可能导致错误结果和法律纠纷，甚至造成严重后果； 3、各单位可根据不同目的、检测对象、人群流行率、成本-效 益比、实验室设备、和技术水平等选择不同初筛实验方法。,初筛检测中值得注意的几个问题(2),4、不同厂家及同一厂家生产的不同批次试剂的敏感性和特异性可能存在一定差异，各实验室最好应用标准质控血清对新购试剂及在每次检测时进行质量控制和质量评价，以确保检测工作结果的准确可靠性； 5、针对HIV感染的不同时期选用不同的检测方法： 6、HIV抗体的检测反应强度与HIV感染的概率： 许多HIV抗体检测方法既是一种定性实验，也是一种半定量实验。ELISA方法可根据OD值的强度确定抗体量的多少。反应性越强的血清，含有HIV抗体的可能性越大。,滤纸干血斑标本 （dry blood spot （DBS）on filter paper）,是将采集的新生儿血样滴在筛查专用滤纸上而制成的圆形均匀斑状血样 一般专用于新生儿疾病筛查实验检测。 滤纸片是血液标本采集和运输的极好载体，应用全血滴在滤纸片上制成滤纸片干血斑，便于储存和运输，且有很好的生物稳定性，因此，特别适用于发展中国家边远地区的样本采集、贮存与运输。,滤纸干血斑标本 （DBS）的采集,采血对象和采血时机(新生儿生后3天（或4872小时）进行 ) 材料和器具 采血方法和技巧 DBS血斑质量 标本收集方法 标本保存方法,材料和用具,载血滤纸：S&S903的专用滤纸 采血卡,其他材料,信息卡 穿刺针 采血卡支架 75%酒精和消毒干棉球 热水袋或热敷用毛巾,采血方法,符合美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）标准 新生儿筛查计划中滤纸血片的采集方法,采血前准备,登记，查对，填卡，洗手，戴口罩 采血部位清洁，保暖，血循环良好（可用40-42热敷）,采血部位 选择,足跟两侧 涂黑处 允许采血,穿刺和挤压,一次性使用穿刺针。进针23毫米。拭去最初少许血滴（含碎片） 待穿刺点的苍白区消褪后，用母、食指和手掌握持足部，适当施压。,取血,血液顺利流出，等血滴够大时，用载血滤纸的一面轻触血滴，使血样吸进滤纸透过背面 一次形成直径约1厘米的血斑 共取3个血斑 压迫止血,等血滴足够大时 用滤纸轻触血滴,取数个直径 1cm血斑,晾干,室温 水平放置 晾干2-3小时 避免热烤、日晒、紫外线照射、福尔马林或其他有机溶剂熏染、液体污染等,滤纸干血斑标本的送检,原则：尽快送往 最佳：于标本采集后24小时内送出 规范要求：采集后1周内送达,方法,挂号信邮寄 人工投送 专收专投系统（绿色通道 ）是目前最先进的递送技术,HIV检测实验室生物安全,生物安全贯穿实验室活动的始终,实验室要求 样品的采集、运送、接收、使用、保存、处理 检测操作中的生物安全 仪器设备 废弃物处置 意外事故的处理 实验室生物安全管理,个人防护,1.手部皮肤有开放性伤口及其他不适于工作的情况，应暂停工作。 2.皮肤的微小伤口、擦伤、皲裂等，应用防水敷料严密覆盖。 3.充足的防护服、一次性乳胶手套、口罩、帽子和覆盖足背的工作鞋。应将清洁的防护服和其他个人防护用品置于实验室清洁区内的专用处存放。 4.应急冲洗眼睛装置。（30米） 5.工作人员上岗前必须进行HIV抗体和乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等肝炎病毒标志物检测，应接种乙肝疫苗。应每年对工作人员采血检测HIV抗体，血清应长期保留。 6 进实验室工作前要摘除首饰，修剪长的带刺的指甲，以免刺破手套。 7 严禁在实验室内进食、饮水、吸烟和化妆。,个人防护,8 实验操作时应穿合适防护服（白大衣、隔离衣或一次性工作服）、戴手套和口罩、穿实验室专用的工作鞋。如接触物的传染性大、应戴双层手套；含有HIV的液体（样品或病毒培养液）有可能喷溅时，应戴防护眼镜、穿防水（如塑料）围裙。工作完毕，先脱去手套，再脱去防护服，用肥皂和流动水洗手。穿过的污染的防护服应及时放入污物袋中，消毒后方可洗涤或废弃。 操作过程中，如发现防护服被污染应立即更换，如手套破损，应立即丢弃、洗手并换上新手套。不能用戴手套的手触摸暴露的皮肤、口唇、眼睛、耳朵和头发等。不要将手套清洗或消毒后再次使用，因为使用表面活性剂清洗可使手套对水的通透性增加，消毒剂可以引起手套的破损。 9 禁止使用口腔吸液管，必须使用移液器来操作实验的所有液体。,意外事故处理,1.皮肤针刺伤或切割伤，应立即用肥皂和大量流水冲洗，尽可能挤出损伤处的血液，用70%乙醇或其它消毒剂消毒伤口。 2 皮肤污染：用水和肥皂冲洗污染部位，并用适当的消毒剂浸泡，如70