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河豚毒素,一.河豚毒素简介及发展历史,二.河豚毒素的生理活性,三.河豚毒素的提取方法,目录,四.河豚毒素未来发展前景,简介,海洋生物毒素的化学结构类型十分特殊,且各类毒素的化学结构差异极大,其中河豚毒素是近年来研究进展中最突出一种海洋毒素。它是一种化学结构独特、毒性强烈并有广泛药理作用的一种天然毒素。其毒素主要集中在卵巢、肝脏和胆囊等处，即使加热也难以破坏，而河豚鱼体内其它部位并无毒素，因此只要处理得当，去掉含有毒素的部位便可放心食用，因此也有拼死吃河豚一话，可见这种毒物的美味是多么的诱人。,河豚毒素的英文名称是tetrodotoxin，简称TTX。是一种剧毒的神经毒素。与酸作用可生成盐， 如氢卤酸盐，酒石酸盐等。 结构式：,河豚毒素 - 化学性质 分子式C11H17N3O8，分子量为319(C11H17N3O8) ，无色棱柱状晶体。对热不稳定。难溶于水，可溶于弱酸的水溶液。TTX 是发现最早的小分子海洋毒素,毒性极大,LD50为8. 7g/ kg ,是氰化钠的1000 倍。河豚毒素怕碱，在碱性水溶液中，其结构迅速受到破坏，毒性很快就会消失。将河豚毒素加热到200，它就会变黑，但不分解，超过220炭化，其毒性很快就会消失。 河豚毒素不溶于水，因此在生产过程中可以用纯水洗去其中的杂质。但是，若从河豚内脏中提取河豚毒素，则又必须通过水来浸泡。只要浸泡一个小时，河豚毒素就能从内脏中流到水里。根据这个原理，人们应该将“拼死吃河豚”改为“拼洗吃河豚”。,河豚,河豚毒素 - 研究历史,我国历代本草如神农本草经和本草纲目中都有河豚的记载。河豚学名：Fugn rubripes，属硬骨鱼纲，鲀形目，鲀亚目，鲀科，是暖水性海洋底栖鱼类，分布于北太平洋西部，在我国各大海区都有捕获，假睛东方豚还经常进入长江、黄河中下游一带水域，而暗纹东方豚亦可进入江河或定居于淡水湖中。 TTX又称原豚素 ( spheroidine) 和东方豚毒素(fugu poison) ，是一种神经毒素，名字来源于动物东方豚属(fugu)河豚(spheroides rubripes)的科名Tet raodontidae 。,河豚味道鲜美，营养丰富，日本、中国、欧洲等国人民素有食用习惯,由于TTX 毒性很强,因食用河豚中毒事件屡有发生。最初1909 年田原对河豚鱼卵的神经毒性进行了描述并命名其毒性成分为TTX 。1938年日本学者横尾晃，首次从河豚中提取出较纯的毒性成分,到1950 年才分离到单体结晶。随后日本津田恭介小组于1952 年，平田義正小组于1955 年，美国的Woodward 小组于1957年和后来的後藤小组相继分离得到了TTX 单体结晶。,TTX 的分子并不大,其结构新颖,在有机溶剂和水中都不溶解, 仅溶于醋酸等酸性溶剂,并且在碱性和强酸性溶剂中不稳定,加之核磁共振技术在20 世纪60 年代刚刚开始应用,给TTX 的结构鉴定带来了相当的困难。为了确定TTX 的结构,日本的津田、平田和美国的Woodward 3 个小组分别制备了TTX 的衍生物并进行X2衍射实验。终于1964 年在京都召开的国际天然产物化学会议上同时报告了TTX 的正确结构,是一种分子量不大但结构很复杂的笼形原酸酯类生物碱,分子中几乎所有的碳原子均有不对称取代。同年Mosher 从产于加利福尼亚的蝾螈中也分离出TTX。1964 年以前日本和美国学者对TTX 的结构进行了深入的研究,报道了多个TTX 的可能结构和部分结构。,河豚毒素 - 生物活性,很多海洋食品中毒事件都与TTX 有关,河豚中毒是鱼类中毒中最为严重的一类,患者病死率高达60 %。 TTX中毒的主要临床表现为知觉麻痹、运动障碍、头晕头痛、恶心呕吐、血压下降、呼吸困难、严重者因呼吸衰竭而死亡。TTX 还是麻醉剂, 其局部麻醉作用是普鲁卡因(procaine)的4000倍,可作为癌症后期的缓解药。TTX 的作用机理与陆地发现的毒素不同,极低的浓度就能选择性地抑制钠离子通过神经细胞膜，但却允许钾离子通过,，TTX 是一种电压敏感的钠通道(voltage2gated sodium channels ,VGSC)外口特异性阻滞剂，神经、肌肉、心肌传导纤维等可兴奋细胞膜生的钠通道，并具有高度专一性,其作用机制是通过与膜上的专一受体结合，再通过关启机制关闭通道,从而阻滞神经细胞的兴奋与传导。,TTX 分子中1 ,2 ,32胍氨基及其附近的C4 ,C9 ,C10 碳上的羟基为活性基团。胍氨基在生理条件下通过质子化形成正电活性区域,与专一受体蛋白的负性羟基结合, 其周围羟基以氢键形式与受体结合,受体位于膜外层离子孔附近。 TTX 是神经生物学和药理学研究极为有用的工具药。TTX 还是一种较强的镇痛药,除对术后疼痛无效外,对其他疼痛均有效,作用缓慢且持久,目前还没有成瘾性的报道。,河豚毒素的药用价值,20 世纪50 年代河豚毒素制剂在临床上扩大了运用。譬如用以治疗关节炎、风湿病、搔痒、阳萎、遗尿、破伤风、百日咳、气喘、头痛等，而且也已做镇痛药。据说河豚毒素用作肌肉松弛剂对痉挛特别有效。 临床上河豚毒素的针剂可以代替吗啡、杜冷丁、阿托品和南美筒箭毒等。用于治疗神经痛时，一般生效较吗啡、杜冷丁迟，但持续时间长，镇痛时间可达1220 小时。注射河豚毒针剂后，部分患者可能产生口、舌知觉异常，头部充血，头痛等反应，但持续时间不长。据临床中毒的尿液化验，河豚毒素在人体内可持2 天之久不被破坏。由于河豚毒素毒性令人生畏，使用受到了一定限制，但在临床上它已有以下几个方面的用途：,第一，对神经、肌肉和关节等创伤、火伤、跌打损伤、挫伤等所产生的疼痛能发挥显著的镇痛作用。尤其是神经、关节、肌肉疼痛，只要不是病疾，应用本品可以完全治愈。 第二，用作搔痒镇静剂，对于冬季皮肤痒症、痒疹、疥癣、皮炎等，有止痒作用，并促进其痊愈。 第三，用作呼吸镇静剂，可治气喘和百日咳等症。 第四，用作镇痉剂，可用于松弛肌肉痉挛、胃痉挛和其他痉挛，特别对于破伤风痉挛，被称为特效药。 第五，用作尿意镇静剂，对遗尿症有良效。 第六，由于河豚毒素具有充血作用，对阳萎和妇女性欲缺乏等亦属有效。但有膀胱及尿路疾病者应忌用，因为毒素能使其粘膜充血或强度寮血。,第七，用作局部麻醉药，由于河豚毒素比一般的局麻药要强上万倍，故国外已有将河豚毒素与普通局麻药配伍而作为局麻药的专利出售。 第八，对麻风病人的痛苦有一定缓解作用。 第九，用于晚期癌症患者的止痛，效果良好，且未见成瘾的报道。 此外，河豚毒素的降血压作用独特。对猫给药23 微克千克体重，则能引起正常动脉硬度突然下降2 / 3 ，而作用时间又比较短，此后仍有继发的低压期。由此可以考虑河豚毒素可能在临床抢救高血压方面有一定用途。河豚毒素药用；要遵照医嘱，自己不可滥用。,提取方法,采用吸附树脂与离子交换树脂提取河豚毒素,对于河豚毒素提取的研究早在50年代就已经开始，,普遍采用的提取方法是离子交换层析法.本文采用G5漏斗抽滤内脏提取液,以除去浸取液中大量的蛋白质,脂肪等大分子杂质,避免了文献中用煮沸方法除蛋白质而造成破坏毒素的可能性,经双缩脲检验表明,滤液中只含有微量的蛋白质,效果良好.然后利用TTX本身较强的极性,将滤液通过D+D101非极性混合吸附树脂进一步除去河豚提取液中大量的非极性或弱极性杂质, 以获得澄清的滤液.再将滤液通过铵型弱酸性阳离子交换树脂D152,由于TTX在溶液中以铵盐C11H16O8N2NH+2存在,与树脂的NH+4发生下列反应: 用10%乙酸洗脱,结合动物中毒实验,即可得到浓缩的强毒母液,再浓缩精制结晶,便可获得晶状的河豚毒素.,R-O-NH+4 + C11H16N2O8NH+2 R-O NH+2O8N2H16C11 + NH+4 或: R-COO-NH+4 + C11H16N2O8NH+2R-COO- NH+2O8N2H16C11 + NH+4,2 实验材料和试剂 (1)吸附树脂: D,D101,非极性,天津化工厂产. (2)弱酸性阳离子交换树脂: D152,铵型,南开大学验厂生产. (3)交换柱和吸附柱:交换柱为25300mm,吸附柱80800mm. (4)河豚鱼(Fugn.spp.):捕于广东沿海. (5)小白鼠:体重15-30g. (6) HAC: 10%. (7) Ds-200高速组织捣碎机. (8) G5漏斗及抽滤装置.,3 实验过程 (1)吸附树脂的处理 将D,D101各一半用酒精浸泡24小时,再换新鲜酒精浸泡24小时,然后用纯水漂洗至无乙醇残留.选用 80800mm的柱进行湿法装柱. (2) D152弱酸性阳离子交换树脂的处理 用酒精浸泡D152树脂24小时后,用水漂洗干净,选用 25300mm的柱进行湿法装柱,于柱中用4% HCL浸泡树脂4小时,再用水洗涤至流出液不含CL-,再以10%NH3H2O流经树脂,将树脂转为铵型,然后用纯水冲洗树脂至流出液不含游离氨.,(3)河豚内脏浸取液的制备 将捣碎的河豚内脏用水浸泡36小时(水与内脏重量之比为2:1),用虹吸法吸出浸取液,反复3-4次,合并后将浸取液用G5漏斗抽滤,得到PH=7.1,透明、无味、浅黄色的滤液.用双缩脲检验滤液,只含有微量的蛋白质,表明大部分蛋白质已被G5漏斗滤去.以每组5只体重15-30g健康小白鼠进行中毒实验,每只腹腔注射0.8ml不同浓度的上述滤液,小白鼠死亡的时间因毒力强弱而不同,但死亡症状一致.最初表现平静,继尔出现不突然旋转,大呼吸,最后突然跳起,翻身,四肢痉挛,腹部朝上死亡。,(4)用吸附树脂除去非极性及弱极性杂质 将上述滤液以12ml/min的流速流经D+D101混合树脂吸附柱,得到无色透明的流出液.取少量流出液加热至沸,无混浊.再取少量流出液经双缩脲检验已无蛋白质存在。取流出液进行小白鼠中毒试验,症状同上.从而可知,大量有色杂质,蛋白质等非极性及弱极性杂质已被吸附树脂吸附,而具有强极性的毒素则随流出液流出. (5)用铵型弱酸性离子交换树脂分离毒素 将吸附柱的流出液以1ml/min的流速流经D152铵型弱酸性交换柱.取流出液进行动物中毒实验,小白鼠无异常,用奈斯勒试剂检查流出液有游离氨存在,表明毒素已被交换到树脂上.,(6)洗脱和结晶 先用纯水洗涤交换柱,再用10% HAC洗脱,分批收集洗脱液并进行小白鼠中毒实验,结果见表1所示.,表1 洗脱液的中毒实验,将含有毒素的洗脱液合并,在60减压蒸馏至20ml,加入Na2CO3即析出河豚毒素的白色结晶. 结论 (1)河豚内脏浸取液经G5漏斗抽滤后,滤液中只含微量蛋白质,滤液经吸附树脂后, 微量蛋白质进一步被除去,从而可避免采用加热煮沸除蛋白质时对毒素的破坏.故本文除蛋白质的方法是可行的. (2)实验表明,D+D101混合吸附树脂对TTX毒素不具吸附力,而能吸附滤液中的非极性和弱极性杂质,而使TTX与上述杂质分离. (3)在实验条件下,D152铵型弱酸性阳离子交换树脂对TTX毒素具有较大的亲和力,TTX毒素能有效地交换到树脂上,从而达到分离富集的目的.,G5漏斗抽滤,滤液,D+D101非极性吸附树脂,澄清滤液,铵型弱酸性阳离子交换树脂D152,10%乙酸洗脱,强毒母液,浓缩精制,晶状的河豚毒素,河豚内脏浸取液,工艺流程,河豚毒素 - 应用前景,尽管TTX 及其类似物作为防御性化学武器广泛分布于海生动物和两栖动物中,但对它们的生物合成途径还知之甚少。很多细菌可以合成TTX 及其类似物,但为什么要合成这些毒素,为什么TTX集中分布于河豚鱼的卵巢部位,目前还没有得出肯定的结论。 加拿大科学家却利用河豚毒素研制出一种能止痛的新型药物。这种新型特效止痛药能够有效地缓解癌症病人的疼痛。目前这个课题已经做完一期和二期的临床实验。在临床实验中医生每天给病人注射两次这种药剂，一次几微克，连续注射4天。当用药进入第3天后，患者的疼痛开始减轻。结果，有将近70的病人的病痛得到缓解。,研究人员还发现，最后一次注射停止后，止痛效果仍可延续。在一些病例中，止痛效果甚至可以延续15天。加拿大多伦多大学药理学教授爱德华赛勒斯说，这种药物可以阻断发向大脑的有关疼痛的神经信号，其止痛效果比吗啡强3000倍。,河豚毒素 - 价格 目前，在国际市场上，河豚毒素结晶每克已经高达17万美元。在欧洲市场上，它的广告价位高达每克40万美金，相当于黄金的21333倍。 河豚毒素 - 存在问题 近年来关于TTX 及其类似物的不对称合成已经完成,但其产量低,目前TTX 的供应主要依靠于从河豚中直接提取,致使TTX 类化合物非常昂贵,这在一定程度上限制了TTX 类化合物作为工具药的广泛应用。,河豚毒素 - 医药开发前景,1909年日本田原良纯首次报道河豚毒素提取工艺，其纯度只有0.2，随后50年代横尾等又相继报道了改进工艺，我国直到上世纪80年代才由河北省水产研究所与中国人民解放军药物化学研究所共同合作提取成功,于1982年1月9日鉴定通过，打破了日本在这方面的垄断技术。河豚毒素粗品的提取方法大同小异：使用水浸泡、酸提取，盐沉淀除杂质，再用氨水沉淀，得到河豚毒素粗品。随着科技的发展和技术的更新，河豚毒素纯化工艺有很大改进，从田原良纯提取得到的粗品的基础上采用氧化铝柱层析进行纯化，随后又改进为活性炭柱层析纯化等方法。,宫庆理等采用大孔树脂D201和离子交换树脂IRC286进行吸附，用去离子水将杂质洗掉，再用酸将河豚毒素洗脱下来，采用高效液相色谱制备得到高纯度的河豚毒素，纯度为99.5，粗品精制得率为81.1%，将河豚毒素的纯化工艺又提高了一个层次。目前的提取纯化工艺成熟，在提高产率的同时，又能获得高纯度的河豚毒素，确保了河豚毒素原料的生产。 国内的研究检测方法主要是在国外的研究基础上进行的，并没有太大的改进。目前的研究检测方法足以确保河豚毒素药品的质量检测，很少有报道研究河豚毒素有关物质的方法，所以还应对其有关物质的检测方法做研究，确保河豚毒素药品质量和用药安