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文档简介
DNA 限制性内切酶消化,实验原理,限制性内切酶：识别回文序列，产生粘性或平性末端，具有相同粘性或平性末端的不同DNA片段可连接起来形成重组DNA分子，故DNA限制性内切酶是分子生物学实验中重要的工具酶。 影响酶活性的因素有很多，温度、pH值、离子强度、激活剂或抑制剂等都影响酶的酶切活性,实验原理,每种酶有其最适的缓冲体系（低盐、中盐、高盐等） 单酶切反应 双酶切反应,酶反应体系：,底物DNA 限制性内切酶：1-5U/gDNA pH TRis-HCl缓冲液 小牛血清白蛋白 NaCl 温度:37 时间：1-2h,实验步骤,pBR322 2 l Pst 2 l EcoR 2 l 10Buffer 2 l ddH2O 12 l 总体积 20 l,封口膜封口, 瞬时离心,37 水浴，2h,65 加热灭活终止反应,冰水浴,DNA琼脂糖凝胶电泳,原理： 琼脂糖凝胶电泳通过电荷效应和分子筛效应分离不同分子量大小的DNA，相同分子量的DNA分子若构型不同电泳速度亦不同。 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片段的典型方法，特点是制备简单、快捷，灵敏,溴化乙锭为荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，与与核酸结合成荧光复合物，在紫外线254 365nm照射下呈桔红色荧光。电泳时所需DNA样品量仅0.51g.,线性DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度的关系,实验步骤,琼脂糖溶液的制备 溴化乙锭浓度0.5g/mL 凝胶板的制备 上样 电泳 电压10v/c
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