细胞的原代培养原理.ppt

细胞的原代培养 (Cell primary culture),实验 十一,背景资料,原代培养(primary culture)： 从生物体取材进行培养，中途不分割培养物、不更换培养物的生长器皿。 细胞的生长条件： 无菌 温度 pH 渗透压 氧气 营养及生长调节因子,背景资料,培养细胞的生长类型,贴附型,成纤维细胞型细胞,上皮型细胞,游走型细胞,多形型细胞,悬浮型,1、成纤维细胞型： 胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形 核，胞质突起，生长时呈放射状。 除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起 源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管 内皮等常呈本型状态。 培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为 成纤维细胞。,背景资料,2、上皮型细胞： 细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细 胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动， 处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。 起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生 物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮 型形态。,背景资料,3、游走细胞型： 呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。 4、多型细胞型： 有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，统归于此类。,背景资料,悬浮型： 胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这 类细胞容易大量繁殖。 见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及 白血病细胞。,背景资料,原代细胞培养的一般方法: 植块培养法(explant culture) 分离(散)细胞培养法 (dissociated cell culture),背景资料,一、心肌细胞、表皮细胞的培养 二、淋巴细胞的培养,心肌细胞、表皮细胞的原代培养,实验目的,了解细胞体外培养的原理、基本方 法，掌握无菌操作方法及注意事项。 学习观察体外培养细胞的形态及生长 状况。,实验原理,来自机体的细胞、组织、器官； 类似体内的体外环境； 人工培养条件下生存、生长、繁殖。,主要仪器： 纯水仪；离心机；CO2培养箱； 电热干燥箱；高压蒸汽消毒锅；过滤器及0.22 m滤膜； 超净台；眼科剪、镊；培养瓶；青霉素瓶；平皿；吸管；移液管；血球计数板,实验用品,实验用品,实验材料： 712日龄的鸡胚,实验用品,实验试剂： （1） M199 培养液 （2） 小牛血清 （3） 青、链霉素 （4 ） Hanks液 （5） 5NaHCO3 （6） 2碘酒 （7） 75酒精,实验步骤,一、培养前的准备工作 （1） 清洗与消毒 （2） 配制溶液 （3） 预热溶液 （4） 紫外线消毒 （5） 洗手和着装 （6） 进入无菌室,实验步骤,二、植块培养法培养鸡心肌细胞 （1） 配培养液： 含抗生素的M199基础培养液 9 ml 小牛血清 1 ml 过滤除菌。,实验步骤,（2） 获取心脏： 消毒鸡蛋 取出鸡胚，Hanks液洗涤。 取出心脏，Hanks液清洗。,实验步骤,（3） 处理心脏 漂洗心脏，剪成约1 mm3大小的小块。 将组织块排放在培养皿中，贴壁 培养,实验步骤,三、植块培养法培养鸡表皮细胞 从鸡胚体表撕取表皮，剪成组织块进行培养。具体实验操作过程与心肌细胞的培养相同。, 严格无菌操作。 植块培养时注意黏附，加液量不 可过多或过少，过多，会漂浮； 过少，会干死。,注意事项,四、观察培养结果 培养23天，细胞从植块向外迁移，随着培养时间延长，在植块周围形成一圈细胞“晕”，称之为生长晕(growth hallow)。,实验步骤,淋巴细胞的培养 (Lymphocyte culture),实验目的,学习悬浮细胞的培养方法 细胞活力检查 悬浮细胞的形态特征观察,实验原理,外周血淋巴细胞表面具有有丝分裂原受体，当在培养液中加入有丝分裂原PHA时，可与淋巴细胞表面的相应受体结合使其激活，从而促进淋巴细胞增殖。,主要仪器： 纯水仪、离心机、CO2培养箱、 电热干燥箱、高压蒸汽消毒锅、过滤器及0.22 m滤膜、 超净台、培养瓶、离心管、吸管、移液管、血球计数板、一次性注射器,实验用品,实验用品,实验材料： （肝素）抗凝血 注射器中吸入0.1 ml 180 IUml肝素钠溶液，鸡翅下静脉采血5 ml。,实验试剂： （1）RPMI 1640 培养液 （3）肝素钠（180 IUml） （5） PHA（2 mg/ml） （7） 5NaHCO3 （9） 2碘酒棉球 （11） 1%台盼蓝,实验用品,（2） 小牛血清 （4） 青、链霉素 （6） Hanks液 （8） 1N 盐酸 （10） 75酒精棉球,实验步骤,（1） 配培养液： RPMI 1640基础培养液 80 小牛血清 20 肝素（180 IUml） 3.6 IU/ml PHA（2 mg/ ml） 40 g/ml 青、链霉素 100 IU/ml 100 g/ml 调pH至6.87.2，0.22 m滤膜过滤除菌。,实验步骤,（2）采血：肝素抗凝，静脉采血。 （3）分离淋巴细胞 （4）洗涤淋巴细胞 （5）细胞计数、细胞活力检查 （6）稀释培养,实验步骤,（7） 结果：培养3天后观察结果。 细胞计数：淋巴细胞增殖情况。,注意事项,过滤消毒 淋巴细胞的分离 洗涤：Hanks 液、RPMI 1640培养液4 ml 各洗涤一次。 4. 计数：