微生物实验常识.ppt

表1 我国各主要土壤的含菌量(万/克干土),土类 地点 细菌 放线菌 真菌 暗棕壤 黑龙江呼玛 2,327 612 13 棕壤 辽宁沈阳 1,284 39 36 黄棕壤 江苏南京 1,406 271 6 红壤 浙江杭州 1,103 123 4 砖红壤 广东徐闻 507 39 11 磷质石灰土 西沙群岛 2,229 1,105 15 黑土 黑龙江哈尔滨 2,111 1,024 19 黑钙土 黑龙江安达 1,074 319 2 棕钙土 宁夏宁武 140 11 4 草甸土 黑龙江亚沟 7,863 29 23 嵝土 陕西武功 951 1,032 4 白浆土 吉林皎河 1,598 55 3 滨海盐土 江苏连云港 466 41 0.4,1、取土样 选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约 2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取210cm处的土壤。 盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎 石、植物残根等。土样取回后应尽快投入实验，同时取10- 15g，称重后经105oC烘干8h，置于干燥器中冷却后再次称重， 计算含水量。,四、土壤微生物的分离和计数,2、 倒平板 熔化已灭菌的上述4种培养基并冷却至45oC左右倒平 板，凝固待用，每种培养基每个稀释度各三只平板。,8. 计数 选菌落分散、菌落数适量且各平行皿菌落数接近的稀 释度的平皿计数，通常细菌和放线菌选取菌落数在30300 之间的平皿，霉菌选菌落数在10100之间的平皿，最后换 算成每克干土所含菌数。 同一稀释度的平均菌落数稀释倍数 每克干土含菌数 = 1土壤含水量,一、水样采集,自来水水样：先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5 min（经常用水的水龙头放水13min）后，采集水样于无菌锥形瓶，约占瓶容量80%，以便摇匀水样。 水源水水样：选有代表性的地点及可疑地方，一般距水面下1015cm采样。采样后，将瓶塞盖好，再从水中取出。,注意事项 严格无菌操作。 做好标记：采得水样后应立即记录水样名称、地点、时间等项目。 从速送检。水样从采集到检验不应超过2h，在04下保存不应超过24h。,二、菌落总数的测定, 平板菌落计数法,方法 稀释水样： 无菌吸10ml混匀水样注入90ml灭菌水瓶中,混匀成1:10水样。 取1:10水样1ml注入9ml灭菌试管中混匀成1:100水样。同法稀释成1:1000, 1:10000水样。,方法 倾注培养： 用1ml无菌吸管吸取23个适当浓度的稀释液1ml,分别注入无菌平皿中，每个稀释度应同时做2个平皿，另取一平皿作空白对照。再做倾注培养(方法同饮用水)。 菌落计数：方法同饮用水。,菌落总数测定,结果分析与报告 计算不同稀释度的平均菌落数： 稀释度的选择和菌落总数报告方式： 首先选择平均菌落在30300之间者进行计算。 计算方法和报告方式如表1所示。,由表2可判定水质被污染的程度。 表2 一般水源水中菌落总数与水清洁程度的关系,1.9灭菌与消毒,消毒：是指应用物理或化学方法杀死物体表面和内部的病原微生物，而对非病原微生物 及其芽孢并不严格要求全部杀死。用于消毒的化学物质，称为消毒剂。 灭菌：是指杀死一切病原菌和非病原菌及其芽孢，使物体上无任何存活的微生物,消毒与灭菌的区别 消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体. 灭菌是指杀灭一切微生物的营养体,芽孢和孢子.,干热灭菌法,灼烧灭菌法：利用火焰直接把微生物烧死。此法彻底可靠，灭菌迅速，但易焚毁物品，所以使用范围有限，只适合于接种针、环、试管口及不能用的污染物品灭菌。 干热空气灭菌法：这是实验室中常用的一种方法，即把待灭菌的物品均匀地放入烘箱中，升温至160，恒温1小时即可。此法适用于玻璃皿、金属用具等的灭菌。,湿热灭菌法:,在同样的温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好，这是因为一方面细胞内蛋白质含水量高，容易变性。另一方面高温水蒸汽对蛋白质有高度的穿透力，从而加速蛋白质变性而迅速死亡。,图412 细菌菌落形态。（a）肉眼观察的细菌菌落形态的多变性。菌落总体形状和边缘状况可由菌落上方俯视观察。而菌落高度则由平板边缘水平观察。,1、简单染色,(四）实验方法：,制片染色水洗干燥镜检,（1）制片：取菌种培养物常规涂片、自然干燥、加热固定；,注意无菌操作,芽孢有的长在中央或近中央，圆形或椭圆形，芽孢的大小，位置，在分类鉴定上有一定的意义，它仅仅是芽孢细菌生活史的一个环节，它还是检验培养基灭菌彻底不彻底的依据。,中央芽孢,偏端芽孢,游离芽孢,末端芽孢,荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶状物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽。由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且可以溶于水，易在用水冲洗时被除去。,荚膜虽不是细胞的主要结构，但它是细胞外碳源和能源性贮藏物质，并能保护细胞免受干燥的影响，同时能增加某些病原菌的致病能力，使之抵御宿主吞噬细胞的吞噬。,荚膜染色结果 背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即荚膜。,（二）实验原理,放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体带一类革兰氏阳性细菌。,放线菌菌落形态,（二）实验原理,酵母菌是多形的、不运动的单细胞真核微生物。无性繁殖主要是出芽生殖。,本实验通过用美蓝染色浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。,美蓝（氧化型） 蓝色,美蓝（还原型） 无色,还原剂,氧化剂,美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对酵母的活细胞进行染色。,死活细胞鉴别原理,美蓝（氧化型） 蓝色,美蓝（还原型） 无色,酵母活细胞,新陈代谢,还原能力,（一）实验目的 （二）实验原理 （三）实验器材 （四）实验方法 （五）实验作业,培 养 基 的 制 备 与 灭 菌,实验五,（一）实验目的,1、明确培养基的配制原则； 2、掌握配制培养基的一般方法和步骤； 3、了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围； 4、掌握高压蒸汽灭菌技术，了解几种常用灭菌方法。,（二）实验原理,培养基是按照微生物生长繁殖或积累代谢产物所需的各种营养物质，用人工方法配制而成的一种基质。它包括碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水六类营养要素。由于不同微生物细胞组成不同，因而所需营养基质不同，为了分离、培养和鉴定不同的微生物，必须根据其需要，配制合适的培养基. 培养基的种类繁多，根据培养基的成分、物理性状不同，可分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基、固体培养基、半固体培养基和液体培养基,常用加热灭菌法： 1、干热灭菌： 用火焰烧灼或电热干燥箱内高温热空气灭菌 2、湿热灭菌 高压蒸汽灭菌法 间歇灭菌法 煮沸消毒法,灭菌是指应用物理或化学的方法，杀灭物体表面和内部一切微生物营养体、芽孢和孢子。灭菌方法很多，可分为加热、过滤、照射和化学药品法等。,（三）实验器材,1.药品和试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、10NaOH溶液、10盐酸溶液。 2.器材：天平、药匙、瓷缸、玻璃棒、电炉、 PH试纸、试管、三角瓶、分装漏斗、牛皮纸、棉花、线绳、干燥箱、高压锅。,1.称量 按照培养基配方，准确称量各成份放于瓷缸中。 配方：牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g，NaCl5.0g,琼脂20.0g,蒸馏水1000ml,pH7.0。,（四）实验方法,培养基的制备过程 称量-溶解-调节pH值-过滤-分装及包扎-灭菌-灭菌后试管摆放斜面,2.溶解 向上述瓷缸中加入所需要的水量，搅拌，加热使其溶解。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。 3.调节pH值 用玻璃棒沾少许液体，测量PH值。用氢氧化钠和盐酸调节PH。,4.过滤 用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。 5.分装及包扎 根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内（用分装漏斗）或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。最后用牛皮纸将棉塞部分包好。,6.灭菌：高压蒸汽灭菌，1210C灭菌20分钟。,7. 灭菌后试管摆放斜面,注 意 事 项,1、称取药品时严防药品混杂，一把牛角匙称一种药品； 2、蛋白胨极易吸湿，称取时动作要迅速； 2、配制固体培养基时，先将其他药品加热溶解到快沸时，再将称好的琼脂加入，继续加热至琼脂完全熔化，此过程要不断搅拌，以免琼脂糊底，并控制火力，防止沸腾外溢； 4、分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量约为管高的1/5，液体培养基的装量约为管高的1/4，三角瓶的装量不超过瓶体的1/2 ； 5、分装过程中注意不要将培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。,返 回,（一）实验目的 （二）实验原理 （三）实验器材 （四）实验方法 （五）实验作业,微 生 物 的 分 离 与 纯 化,实验六,（四）实验方法,（一）、稀释混合平板法,图14-1 从土壤中分离微生物操作过程,（三）平板划线分离法,交叉划线法 连续划线法,（一）实验目的 （二）实验原理 （三）实验器材 （四）实验方法 （五）实验作业,微生物数量的测定,实验七,（二）实验原理,利用血球计数板在显微镜下直接计数，是微生物实验中一种十分重要的常用微生物计数方法。此法的优点是直观、快速，不论微生物的生理状况如何，都可以在显微镜下一一计数。由于此法得到的是活菌和死菌的总和，故又称为总菌计数法。,实验内容3（微生物的分离平板划线法）,制平板。 凝固后，用接种环取相应的菌液一环（10-1）在平板上划线。 1.连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线。完毕后，倒置于28300C温室培养。 2.分区划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在培养基的一边作第一次平行划线34条，再转动培养皿约600C角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于温室培养。 挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，最后得到纯培养。,平板划线菌落分离效果图,土壤里的微生物,土壤中的微生物主要有细菌、放线菌、真菌等。 它们能够分解植物的枯枝烂叶、动物的遗骸等，使土壤变得更加肥沃。,阅读课本P102，回答下列问题： 1、土壤里的微生物主要有哪些种类？ 3、微生物的作用有哪些？,认识细菌,细菌的三种形态,球形、杆形、螺旋形,细菌的基本结构,观看动画,动物细胞和植物细胞,讨论： 细菌细胞与植物细胞、动物细胞的异同处,细菌的细胞结构由细胞壁、细胞膜、细胞质、没有成形的细胞核、鞭毛（有的细菌有）组成。 与植物细胞、动物细胞相比较，它们都具有细胞质、细胞膜；植物细胞和细菌细胞具有细胞壁，动物细胞没有；细菌细胞具有没有成形的细胞核，植物细胞和动物细胞有成形的细胞核。,认识放线菌,放线菌是一种具有分枝的丝状体。由于菌丝内没有横隔，也没有成形的细胞核，所以一般认为放线菌是一种特殊的细菌。,放线菌的菌丝分为营养菌丝、气生菌丝和孢子丝。 营养菌丝生长在营养物质内，吸收其中的营养。 气生菌丝生长在空气中。 当放线菌生长发育到一定阶段，气生菌丝的顶端形成孢子丝。 孢子丝生长到一定阶段就产生孢子。孢子在适宜的条件下萌发，形成新的菌丝体。,认识真菌,酵母菌、霉菌和蘑菇都是一些常见的真菌。 霉菌的种类很多，最常见的有青霉和匍枝根霉。,观察青霉和匍枝根霉,橘皮上的青霉,青霉的形态,青霉的种类很多，从有些青霉中可以提取青霉素。 青霉素是一种常用的抗生素，对治疗肺炎、脑膜炎等疾病具有显著效果。,阅读P111资料“青霉素和弗莱明”,馒头上的匍枝根霉,匍枝根霉的形态,P105讨论：,青霉和匍枝根霉在形态上呈丝状，它们依靠孢子进行繁殖。 青霉的直立菌丝内有横隔，顶端呈扫帚状，成熟的孢子呈青绿色； 匍枝根霉的直立菌丝内无横隔，顶端呈球状，成熟的孢子呈黑色。 它们细胞内没有叶绿体。是通过营养菌丝从营养物质内吸收水分和获得有机养料，进行腐生生活。,香茹,平菇,食用菌,名贵中药材,名贵食用菌,剧毒真菌,真菌的主要特征,真菌的菌体没有根、茎、叶，大多数种类是多细胞个体；细胞里不含有叶绿体，不能进行光合作用制造有机物，只能进行腐生或寄生的生活，依靠孢子进行繁殖。真菌是一类低等的生物。,寄生,腐生,生活在一起的两种生物，一方获利，而另一方遭受损害。寄居在别种生物上并获利的一方称寄生物，被寄居并受害的一方被称为寄主。如寄生在人体内血吸虫、蛔虫。,抗生,指一个物种通过分泌化