中枢神经系统疾病的基因治疗.ppt

中枢神经系统疾病的基因治疗,石奕武 神经科学研究所 广州医学院第二附属医院,概 述,定义 早期是指用正常的基因整合入细胞基因组，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。,目前广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。,基因治疗的概念,基本程序,治疗性基因的选择,基因载体的选择,回输体内,重组表达载体,应用与展望,1）单基因缺陷病 2）体细胞的基因治疗 3）靶细胞可以从病人机体获取 4）治疗效果胜过危害 5）表达水平无需严格调控 6）动物实验证明符合严格的安全标准,研究概况 1990年，美国批准了人类第一个对遗传病进行体细胞基因治疗的方案， 即将腺苷脱氨酶（ADA）导入一个4岁患有严重复合免疫缺陷综合征 （SCID）的女孩。采用的是反转录病毒介导的间接法，即用含有正常人 腺苷脱氨酶基因的反转录病毒载体培养患儿的白细胞，并用白细胞介素 （IL2）刺激其增殖，经10天左右再经静脉输入患儿。大约12月 治疗一次，8个月后，患儿体内ADA水平达到正常值的25，未见明显副 作用。此后又进行第2例治疗获得类似的效果。致使世界各国都掀起了 基因治疗的研究热潮。,经过十几年的发展，基因治疗已取得初步的临床疗效，例如2000年 法国巴黎内克尔儿童医院利用基因治疗使11名有免疫缺陷的婴儿恢 复了正常的免疫功能,尽管后来有一名儿童患了白血病,但这仍是近 十年来基因治疗取得的最大成功。目前每年用于基因治疗上的总投资 在10亿美元左右，主要集中在美国，其次是欧洲。到2001年底全世界 已批准了600个基因治疗临床试验方案，其中针对癌症治疗的方案居首 位，有378个方案，占总数的63.1%；其次是针对单基因疾病、心血管 病、传染性疾病（主要是HIV）、基因标记和其他疾病治疗方案。,神经系统疾病的防治-人们面临的巨大挑战 大多数炎症、营养缺乏性疾病及良性肿瘤等， 通过传统的药物、手术和饮食疗法可以治愈 相当多的疾患不能治愈-帕金森病、亨廷顿病 等 有一些疾病至今仍无防治方法，如阿尔茨海默 病及恶性肿瘤等 全新的治疗概念中枢神经系统(CNS)的基因 治疗(gene therapy),一、中枢神经系统基因治疗概述,存在着一定的困难: CNS被严密的骨质系统所包裹,使得一些重要的 物理操作相对难以进行； 完整的血脑屏障(BBB)的存在是向脑内导入基 因转移载体的天然屏障；,神经系统功能的分子机制及其疾病的分子遗传学变 化最近才缓慢地得到了初步的认识,因此,能够通过基 因修饰而得到治疗的神经系统疾病较少; 对于某些CNS代谢性疾病(如溶酶体蓄积病),在出生 之前就已经在细胞内有大量毒性物质的堆积,提示必 需在胚胎期就进行治疗才有可能取得满意的疗效;,神经系统由多种功能不同并且高度分化的细胞组 成,细胞之间存在着不同的、复杂的甚至是变化着的 联系,不同的神经元和胶质细胞之间在结构上和功能 上可能存在着相当大的差异,因此,神经系统远比其 它器官都要复杂;,神经细胞或胶质细胞均很难大量分离以用于原 代培养和遗传修饰。对成熟神经元和/或胶质细 胞进行遗传修饰并有效地进行脑内移植的技术方 法还未完全成熟。,随着近年来基因治疗的技术方法上的进展, 初步 结果显示基因治疗在CNS疾病的治疗中也具有广 阔的应用前景。其原因在于: 随着定位克隆和疾病相关基因的分离和鉴定技 术的发展,越来越多的神经系统疾病的遗传学病 因得到了澄清;,随着对疾病发生发展的分子机制了解的 深入,目前已经确认的基因治疗方法不仅适 用于有明确基因改变的遗传性疾病,而且也 适用于非遗传性疾病的治疗;, 可以使用非神经细胞或非胶质细胞(如自 体成纤维细胞或成肌细胞)作为遗传修饰细 胞; 最近发现有些药物可造成BBB的一过 性渗透性损伤,从而使大分子物质甚至基因 转移载体进入脑内;,已成功地构建了一些新型的、能够感染非 分裂期终分化细胞(如神经元)的病毒基因转 移载体(如复制缺陷型重组腺病毒、疱疹病毒 及腺病毒相关病毒等),从而使向成熟神经元 和/或胶质细胞内直接进行基因转移成为可 能。,（一）中枢神经系统基因治疗的分类,根据靶细胞分类 生殖细胞(germ cell)基因治疗:将受精卵或早期 胚胎细胞做为治疗目标进行生殖细胞的基因治疗 是可行的；受精卵或早期胚胎细胞的遗传改变势 必影响后代，伦理学障碍和技术上的困难使生殖 细胞基因治疗目前仍为禁区。,体细胞(somatic cell)基因治疗：体细胞基因治疗 只涉及体细胞的遗传转变，不影响下一代，现已被 广泛接受做为CNS严重疾病的治疗方法之一，在现代 伦理道德上是可行的。方法上易于施行，而且已取 得了可喜的成果。,根据基因转移的途径 in vivo (活体直接转移，或称一步法)： 指将含外源基因的重组病毒、脂质体或裸露的DNA直 接导入CNS内；操作简便、容易推广。 尚不成熟，存在疗效短、免疫排斥及安全性等问题 基因转移研究的方向，只有in vivo基因转移方法成 熟了，基因治疗才能真正走向临床。,指外源基因克隆至一个合适的载体，首先导入体外 培养的自体或异体(有特定条件)的细胞，经筛选后 将能表达外源基因的受体细胞重新输回受试者CNS内, 实质上就是遗传修饰细胞的脑移植。 经典、安全、而且效果较易控制，但是步骤多、技 术复杂、难度大、不容易推广。,ex vivo(离体转移或称二步法),（二）中枢神经系统基因治疗的策略 根据宿主CNS病变的不同，CNS基因治疗的策略也不同，概括 起来主要有下列四种： 1、基因替代(gene replacement) 指去除整个变异基因， 用有功能的正常基因取而代之，使致病基因得到永久的更 正。 优点：遗传性疾病等的最理想的方法 缺点：难以实现,2、基因修正(gene correction) 将致病基因的突变 碱基序列纠正，而正常部分予以保留。 如基因打靶技术(同源基因重组)的研究进展已表明， 哺乳动物细胞基因组确实存在着某些结构和酶学机 制，可使外源DNA在特定的部位进行重组，从而使缺 陷基因在原位特异性修复成为可能。,3、基因增强(gene augmentation) 将目的基因导入病变细胞或其它细胞，目的基因的表达产物可以补偿缺陷细胞的功能或使原有的功能得到加强。 近十年来已经发展了许多有效的方法可将目的基因导入真核细胞，并获得表达，因而是目前较为成熟的方法。最适宜隐性单基因疾病的治疗,4、基因抑制(gene constraint)和/或基因失 活(gene inactivation) 导入外源基因去干 扰、抑制有害的基因表达。如向肿瘤细胞导入 肿瘤抑制基因(如Rb或p53)，以抑制癌基因的 表达。,此外利用反义技术(antisense technology)封 闭某些特定基因的表达，以达到抑制有害基因 表达的目的，已被广泛用于CNS恶性肿瘤(如胶 质母细胞瘤)等的基因治疗研究中。,（三）中枢神经系统基因治疗的原则 必须分离出含有调节序列的特异性基因； 必须能够获得足够数量携带该基因的载体或/ 和细胞；,必须建立一条有效的途径将该外源基因导入脑 内、转染靶细胞；最后转染入宿主脑细胞的目 的基因必须能产生足够量的产物，可维持适当 长的时间，且不产生有害的副作用。 导入CNS内的基因要特异、稳定、高效、安全并 具有可调控性。,1、目的基因的选择 该基因的异常是疾病发生的根源； 该基因遗传的分子机制清楚； 基因已被克隆，一级结构和表达调控机 制较为清楚；,可在体外操作，而且安全有效； 转移基因在受体细胞内最好能够完整地、 稳定地整合并能适时适量表达功能性蛋白 质。,染色体基因组 互补DNA (complementary DNA，cDNA) 多数是通过cDNA的克隆化技术得到的。可应 用人工合成、PCR技术扩增等途径获得目的基 因,2、目的基因来源：,目的基因必须置于合适的启动子的控制之下， 编码基因的信号肽序列(signal sequence)必须 完整，只有这样，目的基因才可获得适当的表 达，基因调控是目前基因治疗研究的薄弱环 节。,其原则为：最好选择组织特异性细胞，即外源基因仅 在该系统组织中表达，而在其它组织中不表达或表达水 平较低；细胞要易于从体内取出，有增殖趋势，且生 命周期较长，使得有足够的时间进行体外基因操作；,3、 受体细胞的选择 -成败的一个关键因素，选择病变发生细胞/非病变发生细胞,离体的细胞要能接受外源基因的转染； 细胞经过体外基因操作后能够存活下来，并能安全输送回体内； 能预设某一安全机制，在必要时可激活以阻止修饰细胞在体内有害的生长和/或有害功能的发挥，以避免肿瘤发生。,目前，应用于CNS基因治疗研究的靶细胞主要有 成纤维细胞、原代骨骼肌细胞、胶质细胞、胚胎 中脑细胞、条件永生性神经细胞及神经干细胞。 适合于基因转染及脑内移植的靶细胞最好来自宿 主自身的同源细胞，以避免发生免疫排斥。,胶质细胞 优势是能很好地在体外生长与繁殖，移植到脑内靶点后可很好地存活并整合到脑实质中，可获得长期、稳定的转基因表达，是一种潜在的基因治疗细胞载体； 其缺陷是植入脑内成瘤的危害性大。,胚胎中脑细胞 相对安全，但细胞难于获得，在体外培养较难，且不易用经典方法行基因转染。 神经干细胞 最理想的转基因靶细胞，因它们在生长因子作用下能够不断生长繁殖，且植入脑后也能根据所处环境分化成相应细胞，并与宿主形成突触联系。,4、基因载体的选择 目的基因本身一般不含有启动子等调控序列，导入靶细胞后很难得到目的基因的表达。因此，必须将目的基因重组于表达载体的合适位置，再导入细胞，在特定调控序列指导下进行表达。表达载体有质粒载体(plasmid vector)和病毒载体(viral vector)两大类。,质粒载体 一般可用物理的、化学的以及融合法导入靶细胞。 包含哺乳动物细胞的表达调控元件，细菌胞浆内进 行复制的表达元件，因此被称为穿梭载体(shuttle vector)，意指在哺乳动物细胞和原核生物细胞中 均能稳定复制、稳定存在的基因载体。,目前被广泛应用于哺乳动物细胞的质粒载体 有pSV2，pRSV，pcDNA3和pCI载体系列等。 可插入较大长度的外源基因(10kb以上)， 有较广泛的宿主细胞范围，经转染的细胞不 发生裂解，故可建立稳定分泌外源蛋白的细 胞株，用于ex vivo基因转移。,病毒载体的构建原则与质粒载体相似，但进入靶细 胞的方式不同。目的基因与病毒载体重组形成重组 载体。在基因治疗中多是将此重组载体以不同方式 进行包装，获得重组的病毒颗粒，再感染靶细胞， 以便将目的基因带入靶细胞，并得到目的基因的表 达。有多种病毒载体，其特点各异。,病毒载体,（四）中枢神经系统基因转移的方法和实施途径 CNS基因转移方法分为物理、化学和生物学三大 类。前两类是非病毒的方法，后一类即生物学方 法主要指病毒介导的基因转移，包括病 毒，病毒两类。,1、病毒载体介导途径 即以复制缺陷的重组病毒将靶基因引入体内。许多病 毒载体，包括逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、 腺相关病毒、慢病毒及多种杂交型病毒载体等，已应 用于CNS基因治疗的基础和临床研究。作为基因治疗 的载体，要得到广泛应用，必须简单、安全、可靠， 且能在宿主体内长期稳定表达。,迄今为止，病毒载体用于CNS细胞基因传递 取得了许多进展，尽管其安全性及效率仍 有待提高，但in vivo方法已成为目前CNS 基因转移的主要研究方向，只有in vivo方 法取得成功，CNS基因治疗才能走向临床。,重组病毒载体因其自然感染途径而成为较有效的 基因转移手段，病毒载体用于脑内基因传递应具 备哪些特点呢？1、插入基因的容量必须足够 因载体内包含了目的基因、特异性调控序列及可 诱导的启动子；,病毒载体的特点,2、脑内基因注射存在容量限制问题，故向特定神 经元细胞群转染目的基因时，载体的转染效率及 滴度必须较高 3、转基因产物的稳定表达是必要的，由于启动子 的失活，载体序列的物理丧失，细胞毒性效应及 外源蛋白的免疫反应，此目标常常较难实现。,4、转基因产物表达量的可调控性也是重要的，载体中 包含的特异性调控序列对治疗控制是必要的。病毒载体具有 CNS细胞特异性的靶向性，即病毒载体能通过细胞特异性启动 子、特殊的受体表达或轴浆运输路线，选择性地感染某些细 胞。病毒载体介导的基因转移能应用于临床，无毒 性或炎症性免疫反应是必要的。,2、非病毒介导途径 即通过物理法、化学法或融合法直接将目的基因导入 体内。 避免重组病毒包装过程中产生的野生病毒污染和免疫 反应，具有安全、操作简单、插入容量不受限制及可 通过物理方法实现靶向性转移（如基因枪）等优点。,直接导入的DNA通常难以整合入基因组，基 因表达存在不稳定性，且在非分裂细胞中 基因的转染效率不高，使其应用受到限 制。,迄今为止，在基因治疗研究中所用的非病 毒基因转移法有直接注射法，磷酸 钙转染法、电穿孔法、颗粒轰击技术、脂 质体介导的转移法，受体介导的基 因转移法等。,这些基因转移方法可以转移仅由组成的载 体，并依赖不同机制将大分子物质摄入哺乳动物 细胞中，并在细胞内运输。由此等方法转移的外 源基因的表达是暂时的，因为这些基因不易稳定 整合到宿主细胞的基因组，而易被细胞内的 酶降解，并将其排出胞外。,从概念上说，非病毒基因转移要比病毒基 因转移方法安全。应用这些方法的前提是 重组基因在人组织中只需要暂时性表达， 这在某些疾病如脑肿瘤的治疗中是很有用 的，同时这些基因可以象药物一样被反复 应用。,二、中枢神经系统疾病基因治疗的实验研究,许多实验动物模型已应用于CNS疾病基因治疗 研究，包括神经系统遗传病、神经变性疾 病、脑缺血、脑创伤及脑肿瘤等。这些模型 均可通过药物诱导或损伤诱发，而脑肿瘤模 型则可通过体外培养的肿瘤细胞移植动物脑 内而产生。,随着许多神经系统疾病致病基因的明确，应 用转基因小鼠复制具有人类疾病相同遗传病因 的转基因动物模型已成为现实，这些小鼠模型 包括嗜质体酶缺乏症、视网膜变性综合征，此 外还包括自发性脑肿瘤和神经变性综合征等。,（一）遗传性神经疾病 人类基因治疗最早着眼于遗传性疾病（主要限于单基因 遗传病），随着越来越多CNS遗传病致病基因的发现和克 隆，应用转基因小鼠复制具有人类疾病相同遗传病因的 转基因动物模型也已成为现实，使得遗传性疾病的基因 治疗研究变得更加活跃。,1、Huntington病 一种以基底节和大脑皮层变性为主要病变的常染色体显 性遗传病，主要临床特征是慢性进行性发展的舞蹈样动 作和痴呆。其发病机制仍不清楚，目前，研究发现HD与 IT15基因的单一型突变有关，导致Huntington蛋白中的 多聚谷胺酰胺纤维大量增加，使纹状体GABA能输出神经 元细胞群对兴奋性毒性、氧化应急和线粒体功能障碍的 敏感性增加。,几种HD基因治疗方法已分别在DNA、RNA和蛋白水平进 行了研究，反义基因治疗对这种疾病来说还存在技术 上困难，但保护性基因治疗方法却取得了令人鼓舞的 结果。后者主要包括移植能分泌保护或替代因子的工 程细胞，例如产生NGF的成纤维细胞或神经前体细 胞。,几种神经营养因子，包括BDNF，已被证实有益于纹 状体神经元的存活。Bemelmans等将克隆BDNF基因的 Ad注射至Huntington 病模型大鼠的纹状体中，发现 BDNF的存在能促进纹状体神经元的存活。,2、杜兴氏肌营养不良征,（Duchenne muscular dystrophy,DMD）是男性中最常见的X连锁致死性遗传病，其特点是包括呼吸肌在内的全身骨骼肌进行性萎缩。现已证实dystrophin基因（dystrophin gene）的突变或缺失是导致DMD的主要原因。,目前，dystrophin基因已被克隆，dystrophin全长cDNA约 为14kb。应用dystrophin基因治疗DMD的研究正在进行， Akkaraju等应用第一和第二代复制缺陷型HSV载体，介导全 长dystrophin基因转移至dystrophin缺陷的肌萎缩细胞和 转基因小鼠体内，并观察到dystrophin在肌萎缩细胞中和 小鼠体内的表达，但治疗范围局限于注射部位，因不能得 到全身性的治疗效果，其应用前景并不乐观。,Cho等就此问题进一步进行了探索，他们在 应用重组Ad介导dystrophin基因转移取得成 功的基础上，通过改变血管腔内的Starling 力和肌纤维成熟度，试图从血管内途径给 予克隆dystrophin基因的Ad，从而达到全身 治疗目的。,3、神经退变性疾病： 如帕金森病 目前有两种主要策略： 神经递质合成或代谢酶的基因转移，可部分增强变性系统的功能。 营养因子或保护蛋白的转基因可以延缓或阻止进一步的神经变性进程。,、帕金森病（Parkinsons disease，PD ） 中老年人常见的中枢神经系统变性疾病之一，主要病理 特征为黑质纹状体系多巴胺能神经元进行性死亡，多巴 胺(dopamine, DA)含量显著减少。临床表现为静止性震 颤、肌强直、动作减少及平衡障碍。由于其病因和发病 机制尚未明确，目前的所有治疗手段，包括药物治疗和 各种外科手术只限于症状控制，不能从根本延缓或阻止 其病程的进展。,70年代后期国内外学者曾尝试应用肾上腺髓质细 胞、胚胎黑质细胞、交感神经节细胞及复合组织 细胞移植治疗PD。 取得了一些进展，但由于供体细胞来源困难、免 疫排斥、植入细胞难以在宿主脑内长期存活等诸 多因素，限制了它的临床应用。,目前对PD治疗研究最多、最有前途的方法为基因 治疗。PD被认为是中枢神经系统疾病基因治疗的 最佳模型，因为它的病理机制较明确，病变部位 局限，变性细胞单一，相关的基因已被克隆，有 适当的动物模型，移植的方法也比较成熟。,PD基因治疗主要有两条途径：通过引入左旋多巴 或多巴胺合成酶，提高纹状体内多巴胺含量；通 过引入潜在的神经保护分子，阻止多巴胺神经元 进一步死亡，促进受损的黑质纹状体系统重建和 功能恢复。提高脑内多巴胺含量能减轻其临床症 状，而阻止多巴胺能神经元死亡，则有可能从根 本上治愈该病。,体内多巴胺合成过程中存在两种催化酶， 酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）和 芳香氨基酸脱羧酶（aromatic-amino-acid decarboxylase, AADC），TH是脑内多巴胺生物 合成的限速酶，PD患者TH及TH mRNA的水平明显 低于正常人，而TH mRNA/TH的比值与正常人没有 明显差异，提示通过脑内补充TH基因，可以促进 L-Dopa的生成。,而AADC即使在纹状体失神经支配情况下， 在非多巴胺神经能神经元或胶质细胞中仍充分存 在。故治疗中只需在纹状体内表达外源性TH，多 巴胺含量即可明显提高。但TH的活性功能离不开 辅助因子BH4的作用，在纹状体失神经支配时这 种辅助因子的水平也下降，TH和BH4合成酶， GTP-cyclohydrolase1的联合移植，对获得足够 的L-dopa产物是需要的。,Wolff 等应用逆转录病毒载体将TH cDNA 转染至大 鼠的尾状核，获得了TH的表达，并使模型动物阿扑 吗啡诱发的旋转次数明显减少。Jiao等将含有TH的 表达质粒(pCMVth)在脂质体介导下转染肌母细胞和 肌管细胞(myotube),联合移植于PD大鼠纹状体内， 获得高水平的稳定表达(6个月以上)，使阿扑吗啡 诱导的旋转次数减少了75%。,Anton等将含有TH表达载体的温度敏感性永生 性大鼠神经细胞( 衍生于体外培养的原始中脑 胚胎细胞)THB2和LP6细胞混合移植入2只PD猴 模型纹状体内，结果猴的旋转行为减少了 54%，免疫组化确证了TH的存在。,通过对黑质DA能神经元的保护使黑质纹状体系统得以保 存是PD治疗最佳目标，既可以延缓PD进程，又可避免L- dopa治疗引起的副作用。研究表明应用in vivo或 ex vivo方法将神经营养因子、抗凋亡分子及抗氧化剂等基 因分别转染黑质纹状体系统后，均能达到神经保护治疗 目的。,胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line- derived neurotrophic factor, GDNF）是目前发现的 一种对多巴胺能神经元具有很高的特异性营养活性的 神经营养因子，研究表明外源性的GDNF在黑质、纹状 体内的表达可以对多巴胺能神经元产生十分明显的营 养作用。,GDNF基因的有效表达，可以减缓、阻止甚至逆转多 巴胺能神经元的退行性病变过程，从而从根本上遏 制PD的渐进性病程。Derek等将编码GDNF的一种复制 缺陷腺病毒载体直接注射到帕金森病大鼠中脑黑质 区，证实DA神经元能免受6-OHDA的损害,近年来细胞凋亡在PD发病机制中的作用已被认 识，自由基、某些神经递质、神经毒素及神经营 养因子缺乏等因素启动了这一机制，通过细胞自 身内部基因调控过程，导致黑质纹状体系统多巴 胺(DA)能神经元发生凋亡。,在此认识上，采用各种抗细胞凋亡治疗措施可保 护DA神经元，NTFs已被证实能保护神经元免受凋 亡。Clarkson等证实用GDNF在体外培养胚胎大鼠中 脑DA神经元，其凋亡发生率可降低2%5%。原癌基 因bcl-2其多方位的抗凋亡作用机制已较为明确，将 其基因克隆后转染黑质纹状体系统表达，则可保护DA 神经元免受凋亡。,Mattew(1996)等将携带bcl-2基因的缺陷型单纯疱 疹病毒(HSV)载体转染体外培养的海马神经元后， 证实的bcl-2过度表达能保护神经元免受阿霉素毒 性损害，并观察到其在体内表达时能保护纹状体 神经元免受局部缺血的损害。,AD基因治疗的早期策略是向脑内移植遗传修饰后的 能产生NGF的自体同源细胞或神经前体细胞。除了神 经营养因子外，还可以通过神经递质的恢复和替代 方法治疗AD，胆碱乙酰基转移酶（choline acetylase, ChA）是脑内乙酰胆碱合成的限速酶，AD患者脑内存在 ChA活性下降,乙酰胆碱合成减少。,、阿尔茨海默病 (Alzheimers Disease ，AD),转导ChA基因，提高乙酰胆碱合成，可治疗AD。最 近，Saille等研究发现，表达人类抗凋亡基因bcl-2 的转基因小鼠皮层神经元，可明显抵抗-淀粉样蛋 白的神经毒性损害，提示以抑制神经元凋亡为目的 的AD神经保护基因治疗具有研究潜力。,是一种发生于成年人的致命性神经变性疾病，以进 行性运动神经元变性为特征。其病因目前还不明 确，亦无有效治疗方法。现已证实编码超氧化物 歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的基因 突变与家族性ALS发病有关。研究表明各种神经 营养因子，如CNTF、GDNF、BDNF、IGF-1等可不 同程度保护运动神经元。,4、肌萎缩性侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis ，ALS）,临床研究发现这些神经营养因子全身给药 后，不易通过血脑屏障，甚至出现明显毒性 反应（如CNTF），为了安全向ALS病人体内 引入这些神经营养因子，基因治疗已成为一 种主要研究手段。,目前，几种ALS基因治疗方法正在探索： Aebischer等将球囊包裹可分泌CNTF的工程细胞 移植到ALS患者腰部鞘内，尽管未取得明显的治 疗效果，但可从CSF中检测到CNTF的水平，且未 发现明显毒性作用。,Haase等通过肌肉和静脉内注射Ad介导的CNTF到 进行性运动神经元病突变小鼠，可延长其生存 期和降低神经元变性，而脑脊液内给药被证实 无效。DNF或GDNF可保护新生鼠运动神经元免 受轴突切断引起的变性损害。,Mohajeri等将逆转录病毒介导的GDNF的成 肌细胞，注射至6周龄家族性ALS转基因小 鼠后肢肌肉中，18周龄时接受GDNF成肌细 胞小鼠较对照组体内存在较高数目的运动 神经元。表明产生GDNF的成肌细胞可减慢 疾病进展或延缓这种小鼠运动系统病变的 进展。,最近，Azzouz等将rAAV介导的抗凋亡基因 bcl-2注射至SOD突变转基因小鼠脊髓内， 证实能观察到bcl-2蛋白在脊髓运动神经元 中表达，并能显著增加疾病晚期运动神经 元的数目。,5、脑肿瘤治疗 CNS肿瘤细胞分型较复杂，主要包括星形细胞瘤、胶 质母细胞瘤、脑膜瘤和垂体瘤等，其中前两者约占 50%。尽管依据现有诊疗水平CNS恶性肿瘤不难得到 确诊，但由于其浸润性生长特性及肿瘤细胞基因的 异质性，血液中药物进入脑内困难和CNS较差的免疫 监视作用，使得目前的外科治疗、药物及放射治疗 均不能根治。,通过基因治疗手段弥补当前临床治疗的缺 陷，增加其效力，拓宽治疗范围，包括增 加治疗基因或传递途径的范围，已成为目 前CNS基因治疗最主要的研究课题。,CNS肿瘤的基因治疗，其主要策略包括病毒载体 对肿瘤细胞的直接裂解、抗癌药物的激活、抗血 管生成、肿瘤细胞分裂和转移的抑制、免疫增强 和诱导凋亡。可以从癌基因、生长因子及其复合 体基因，肿瘤细胞内信号转导及细胞周期调控因 子等几方面实施治疗。,前体药物的激活一直是脑肿瘤基因治疗研究的主要 方法。最早用于脑肿瘤转基因治疗研究的是HSV胸腺 核苷酸激酶（thymidine kinase，TK）基因，这种 酶可以将丙氧鸟苷转化为一种毒性核苷酸类似物， 从而干扰了DNA合成导致肿瘤细胞死亡。,但以下缺陷使其临床应用受到限制：基因产 物本身的抗原性，使表达基因产物的细胞发 生非特异性或分裂前死亡；核苷酸类似物的 不扩散性，使其只能在具有缝隙连接的细胞 间转移。,近年来，针对前体药物激活和抗癌药物增效的研 究策略，其数量在迅速增多。例如，细菌来源的 胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase）可激活5- 氟胞嘧啶，变成5-氟尿嘧啶，后者是一种常用的 化疗药，作用类似于丙氧鸟苷。,自杀基因： 某些病毒或细菌产生的酶,药物前体,细胞毒性物质,酶基因(cd),肿瘤细胞,表达相应的酶类(CD),药物前体 (5-FCyt),细胞毒性物质 (5-Fura),杀死肿瘤细胞,6、脑缺血,缺血性脑损害（血流的减慢或出血的毒性）导 致的变性表现为神经功能下降和渐进性形态学 改变。脑细胞缺氧时，通过诱导厌氧糖酵解来 获得能量消耗，可引起兴奋性氨基酸释放、 Ca2+和Na+过度超载、内环境稳定性改变和自由 基损害。增加营养因子、抗凋亡分子和神经递 质等几种基因治疗方法已在研究。,缺血性后神经细胞凋亡机制的证实，使研究者着 眼于减慢或阻止这种损害的发生。在缺血发生之 前或之后，通过HSV增强子载体介导bcl-2基因转 移，可保护神经元免受缺血性损害引起的细胞死 亡。应用Ad介导白细胞介素1受体拮抗剂，能 明显缩小梗塞范围和降低局部缺血后的炎症反 应。,Ad介导神经元凋亡抑制蛋白（neuronal apoptosis inhibitory protein，NAIP）可缩小大鼠海马缺血 损伤的范围。应用HSV载体表达72 Kda热休克蛋白， 也可暂时提高局部缺血区神经元的存活。腺病毒已 被证实能有效地介导脑血管及脑膜转基因，具有血 管扩张功能酶的基因转移能减弱缺血损害，ex vivo 缺血治疗包括移植NGF基因修饰工程细胞至海马，保 护CA1和CA2区的神经元免受损害。,7、疼痛,鞘内和脑内病毒载体介导的基因注射是一种有希望的疼痛治 疗方法。在大鼠模型中，脑脊液中注射一种克隆了内源性阿 片肽-内啡肽基因的重组腺病毒，可诱导软脑膜细胞转 染，转基因细胞可释放-内啡肽基因进入脑脊液，使得这种 神经肽更容易接近阿片受体，结果可以明显减轻炎性过敏疼 痛。用重组HSV将前脑啡肽基因传递至杏仁核，亦可短期内阻 止疼痛发生。,8、 癫痫,随着癫痫发病机制中多基因因素的证实，许多探 索已开始集中于基因治疗。正在研究的方法包 括：应用HSV扩增子载体传递热休克蛋白 （HSP72），保护海马神经元免受海藻酸的毒性 损害。应用Ad介导谷氨酸脱氢酶基因转移，增加 抑制性神经递质GABA的合成。应用脂质体介导胆 囊收缩素，一种抗惊厥和抗阿片神经肽，脑室内 给药可暂时消除声源性惊厥发作。,Gene Therapy,For complex partial seizures: TLE A promising approach for alternative treatment of epileptic patients who are resistant to conventional AEDs.,vector,Adeno-Associated virus(AAV) Safe: never asssociated with human disease Stable: efficient, non-immunogenic, nano particle(20 nm) with limited capacity 5 kb Persist: 99%,Target Gene and Results,AAV 2 containing GABRA4 promotor to drive transgene expression in dentate gyrus(DG) after status epilepticus(SE). Increasing GABRA1 mRNA and protein expression in DG at 1-2 weeks aft