一显微镜的使用及微生物形态的观察.ppt

水处理生物学实验,凌 琪 2017年2月,实验一 显微镜的使用及微生物形态的观察,一、实验目的,1.学习普通光学显微镜的使用方法。 2.结合生物滤池生物膜及曝气池活性污泥的观察,认识原生动物、菌胶团等微生物的形态,并学习测量微生物大小的方法。,二、实验器材,1.生物滤池滤料、活性污泥法曝气池混合液。 2.显微镜、目测微尺、物测微尺、载玻片、盖玻片。,三、实验步骤,(一)显微镜的结构和各部分的作用 机械部分主要包括: 1.镜筒 2.载物台 3.调节器 光学部分主要包括: 1.接目镜 2.接目镜 3.集光器 4.反光镜,显微镜的结构,三、实验步骤,(二)显微镜的使用和保护方法 1.低倍镜的使用方法 2.高倍镜的使用方法,三、实验步骤,3.显微镜的保护法 (1)显微镜应放置在干燥的地方,使用时避免强烈的日光照射。 (2)接物镜或接目镜不清洁时,应当用擦镜纸或软绸揩擦。 (3)用完显微镜后,应当立即放到镜匣中。,三、实验步骤,(三)活性污泥和生物膜的观察 1.标本的制备 (1)活性污泥 取活性污泥法曝气池混合液一小滴，放在洁净的载玻片的中央(如混合液中污泥较少，可待其沉淀后,去沉淀污泥一小滴加到载玻片上；如混合液中污泥较多，则应稀释后进行观察)显微镜的使用及微生物形态的观察。,三、实验步骤,(2)生物膜 A 从生物膜法的构筑物内刮取生物膜一小块,用蒸馏水稀释,制成供显微镜观察用的菌液。对于用石子作滤料的生物滤池,也可取石子一小块,置于冲洗干净的烧杯中,加蒸馏水少许和干净的玻璃珠,摇荡数分钟,使滤料上的生物膜脱落在水中,去掉滤料,再摇荡数分钟,做成菌液(如太浓、不易在显微镜下观察,可进行稀释)。 B 取菌液一小滴,置于洁净载玻片的中央,用洗净的盖玻片覆盖(注意不要有气泡)以备显微镜观察之用。,三、实验步骤,2.显微镜观察 (1)低倍镜观察 A 在选定的接目镜下,利用低倍镜,确定目测微尺一格的长度(单位以um计)。 B 观察所制备的微生物标本玻片,画出所见原生物、菌胶团等微生物的形态草图.选择一个原生动物,量出其尺寸。 C 记下观察所用接目镜和接物镜的放大倍数和算出显微镜的放大倍数。,三、实验步骤,(2)高倍镜观察 A 改用高倍镜观察,画出微生物的形态草图,并与用低倍镜所看到的比较,注意其不同点. B 记下显微镜的放大倍数.,四、显微镜保养和使用中的 注意事项,1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4.观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。 5.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。 6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。,五、思 考 题,油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？ 使用油镜时，为什么必须用镜头油？ 镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？,实验二 微型动物的计数,活性污泥和生物膜是生物法处理废水的主体。污泥中微生物的生长、繁殖、代谢活动以及微生物之间的演替情况往往直接反映了处理状况。因此，我们在操作管理中除了利用物理、化学的手段来测定活性污泥的性质以外，还可借助于显微镜观察微生物的状态来判断废水处理的运行状况，以便及早发现异常情况，及时采取适当的对策，保证稳定运行提高处理效果。为了监测微型动物演替变化状况还需要定时进行计数。,一、实验目的 了解活性污泥或生物膜中微生物及微型动物的数量及生长状况。 二、材料与器皿 (一)显微镜、载玻片、盖玻片、微型动物计数板； (二)活性污泥(或生物膜)样品。 三、方法与步骤 (一)压片标本的制备 1. 取活性污泥法曝气池混合液一小滴，放在洁净的载玻片中央(如混合液中污泥较少，可待其沉淀后，取沉淀的活性污泥一小滴放在载玻片上；如混合液中污泥较多，则应稀释后进行观察)。,2.盖上盖玻片，即制成活性污泥压片标本。在加盖玻片时，要先使盖玻片的一边接触水滴，然后轻轻放下，否则会形成气泡、影响观察。 3.在制作生物膜标本时，可用镊子从填料上刮取一小块生物膜，用蒸馏水稀释，制成菌液。以下步骤与活性污泥标本的制备方法相同。,(二)显微镜观察 1低倍镜观察，要注意观察污泥絮粒的大小，污泥结构的松紧程度，菌胶团和丝状菌的比例及其生长状况，并加以记录和作必要的描述。观察微型动物的种类、活动状况，对主要种类进行计数。 污泥絮粒大小对污泥初始沉降速率影响较大，絮粒大的污泥沉降快，污泥絮粒大小按平均直径可分成三等： 大粒污泥：絮粒平均直径500m； 中粒污泥：絮粒平均直径在150500m之间； 细小污泥：絮粒平均直径150m。,污泥絮粒性状是指污泥絮粒的形状、结构、紧密度及污泥中丝状菌的数量。镜检时可把近似圆形的絮粒称为圆形絮粒；与圆形截然不同的称为不规则形状絮粒。絮粒中网状空隙与絮粒外面悬液相连的称为开放结构；无开放空隙的称为封闭结构。絮粒中菌胶团细菌排列致密，絮粒边缘与外部悬液界限清晰的称为紧密的絮粒。絮粒边缘界线不清的称为琉松的絮粒。实践证明，圆形、封闭、紧密的絮粒相互间易于凝聚，浓缩、沉降性能良好；反之则沉降性能差。 活性污泥中丝状菌数量是影响污泥沉降性能最重要的因素，当污泥中丝状菌占优势时，可从絮粒中向外伸展，阻碍了絮粒间的浓缩，使污泥SV值和SVI值升高，造成活性污泥膨胀。根据活性污泥中丝状菌与菌胶团细菌的比例，可将丝状菌分成五个等级：,o 级：污泥中几乎无丝状菌存在； 级：污泥中存在少量丝状菌； 十 级：存在中等数量的丝状菌，总量少于菌胶团细菌； 级：存在大量丝状菌，总量与菌胶团细菌大致相等； 级：污泥絮粒以丝状菌为骨架，数量超过菌胶团而占优势。,2高倍镜观察 用高倍镜观察，可进一步看清微型动物的结构特征。观察时注意微型动物的外形和内部结构，如钟虫体内是否存在食物胞，纤毛环的摆动情况等。观察菌胶团时，应注意胶质的厚薄和色泽、新生菌胶团出现的比例。观察丝状菌时，注意丝状菌生长、细胞的排列、形态和运动特征，以判断丝状菌的种类，并进行记录。 3油镜观察 鉴别丝状菌的种类时，需要使用油镜。这时可将活性污泥样品先制成涂片后再染色，应注意观察丝状菌是否存在假分支和衣鞘，菌体在衣鞘内的空缺情况，菌体内有无贮藏物质的积累和贮藏物质的种类等，还可借助鉴别染色技术观察丝状菌对该染色的反应。,(三)微型动物的计数 1取活性污泥法曝气池混合液盛于烧杯内，用玻棒轻轻搅 匀，如混合液较浓，可稀释成1：1的液体后观察。 2取洗净的滴管1支（滴管每滴水的体积应预先测定，般可选一滴水的体积为120mL的滴管），吸取搅匀的混合液，加一滴到计数板的中央方格内（见下图）。然后加上一块洁净的大号盖玻片，使其四周正好搁在计数板四周凸起的边框上。,微型动物计数板,3用低倍镜进行计数。注意所滴加的液体不一定布满整个100格小方格。计数时，只要把充有污泥混合液的小方格挨着次序依次计数即可。观察时，同时注意各种微型动物的活动能力、状态等。若是群体，则需将群体上的个体分别计数。,4计算 设在一滴水中测得钟虫50只，样品按1：1稀释，则每毫升混合液中含钟虫数应为：50只2022000只。,四、结果与分析 将观察结果填入下表，在符合处打“”表示： 样品名称： 观察人： 日期： 试比较生活污水中活性污泥与工业废水处理系统中的活性污泥性状以及微型动物的种类、数量等有何差异?,五、问题与思考 怎样通过了解微型动物种类或数量变化，来反映废水处理情况？,实验三,大肠杆菌生长曲线的测定,实验目的 实验原理 实验器材 实验方法 实验结果 注意事项 思考题,1. 了解细菌生长曲线的基本特征，测定大肠杆菌在不同培养条件下的生长曲线。 2. 掌握利用细菌悬液的混浊度间接测定细菌生长的方法。,实验目的,生长曲线就是把一定量的单细胞微生物接种到恒定容积的液体培养基中，在合适的条件下进行培养，在此过程中，其细胞数目将随培养时间的延长而发生规律性的变化，如以细胞数目的对数值（或OD值）为纵坐标，以培养时间为横坐标作一条曲线，即为微生物的生长曲线，它反映了微生物群体的生长规律。依据其生长速率的不同，可把生长曲线分为延迟期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期。这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改变。因此测定微生物的生长曲线，可了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。,实验原理,测定微生物生长曲线的方法很多，有血球计数法、平板菌落计数法、称重法、比浊法等。 本实验采用分光光度计(spectrophotometer)进行光电比浊测定，由于细菌悬浮液的浓度与混浊液成正比，因此，可利用分光光度计测定菌悬浮的光密度来推知菌液的浓度，并将所测得的光密度值（OD值）与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的实生长曲线。,实验原理,1. 菌种 培养1820h的大肠杆菌(Escherichia coli)培养液。 2. 培养基 （1）牛肉膏蛋白胨液体培养基 （2）葡萄糖铵盐合成培养基 3. 仪器或其他用具 721型分光光度计，水浴振荡摇床，无菌试管，无菌吸管等。,实验器材,葡萄糖 2.0g K2HPO4 7.0g KH2PO4 2.0g 柠檬酸钠2H2O 0.5g MgSO4 7H2O 0.1g （NH4）2 SO4 2.0g 水 1 000ml pH 7.2,葡萄糖铵盐合成培养基：,1. 菌种的培养 取大肠杆菌斜面菌种1支，以无菌操作挑 取1环，接入牛肉膏蛋白胨培养液中，静止培养1824h 左右。此菌液用作“种子”培养液。 2. 分装培养基 将牛肉膏蛋白胨液体培养基和葡萄糖铵盐 液体培养基分装11支试管，每管内5ml。用记号笔标明 培养时间，即0、1.5,、3、 4、 6、8、10、 12、14、16 和20 h。,实验方法,3. 接种 用1 ml无菌吸管，每次准确地吸取0.2ml大肠杆菌培养液分别接种到已编号的11支牛肉膏蛋白胨液体培养基和11支葡萄糖铵盐液体培养基试管中，接种后振荡，使菌体混匀。 4. 培养 将已接种的试管置摇床37振荡培养，振荡频率250 r /min（温度和频率可随需要调节）。分别在0、1.5,、3、 4、 6、 8、10、 12、14、16和20 h将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定其光密度值。,5. 比浊侧定 分别以未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基和葡萄糖铵盐液体培养基作空白对照，选用600 nm波长进行光电比浊测定。从最稀浓度的菌悬液开始依次测定，对细胞密度大的菌悬液用未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基和葡萄糖铵盐液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在0.1 0.65之内(测定OD值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布)，记录OD值时，注意乘上所稀释的倍数。,实验结果,将测定的OD600值填入下表：,2. 绘制大肠杆菌的生长曲线： 以上述表格中的时间为横坐标，大肠杆菌的OD值为纵坐标，在坐标纸上作图。所绘制成的曲线即为大肠杆菌在本实验条件下的生长曲线。,在生长曲线测定中，一定要用空白对照管的培养液随时校正仪器的零点。,注意事项,1.如果用活菌计数法制作生长曲线，你认为会有什么不同?两者各有什么优缺点? 2.细菌生长繁殖所经历的四个时期中，哪个时期其代时最短? 若细胞密度为103/ml，培养4.5 h后，其密度高达2 108/ ml，请计算出其代时。 3.次生代谢产物的大量积累在哪个时期? 根据细菌生长繁殖的规律，采用哪些措施可使次生代谢产物积累更多?,思考题,实验四 细菌、霉菌、酵母菌、 放线菌形态的观察,一、实验目的 进一步掌握显微镜的使用方法。 观察几个典型细菌的形态(示范片)。 观察几个典型细菌的构造(示范片)。 观察霉菌、酵母菌、放线菌的形态和构 造，以便找出它们之间及与细菌之间的区别点。,二、实验器材,1、显微镜、擦镜纸、镜油（香柏油）、二甲苯等。 2、示范片 ： 金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、四联球菌、尿八联球菌、链球菌、球衣细菌、大肠杆菌、霍乱弧菌等。 枯草杆菌芽孢、假单胞杆菌鞭毛、固氮菌荚膜等。 酵母菌、霉菌、放线菌等。,三、实验内容,细菌基本构造观察,细菌特殊构造观察,放线菌形态结构,是一类具有丝状分枝细胞的革兰氏阳性细菌，因菌落呈放射状而得名。,放线菌的形态和大小,放线菌呈分枝丝状 ； 菌丝无隔膜，单细胞； 菌丝直径与细菌相似，小于1微米。,放线菌菌丝形态和功能,菌丝形态和功能的不同，放线菌菌丝可分为基内菌丝、气生菌丝和孢子丝三种。,产生无性孢子是放线菌主要的繁殖方式。,霉菌的形态结构观察,霉菌（mould，mold）凡生长在营养基质上形成绒毛状、蜘蛛网状或絮状菌丝体的小型真菌，统称为霉菌。,霉菌的营养体由分支或不分支的菌丝构成。许多菌丝相互交织形成菌丝体。 菌丝的大小：直径约为 2 10m，在光学显微镜下，菌丝细胞呈管状。,霉菌的形态和大小,霉菌的菌丝,从结构来看，霉菌的菌丝有两种： 无隔菌丝：低等霉菌如根霉、毛霉等； 有隔菌丝：高等霉菌如青霉、曲霉等。,在功能上，霉菌的菌丝已有分化，可分为： 营养菌丝： 气生菌丝： 繁殖菌丝：,霉菌的繁殖方式和繁殖结构,霉菌主要靠形成各种无性孢子和有性孢子进行繁殖。 霉菌的无性孢子 厚垣孢子 节孢子 分生孢子 孢囊孢子,根霉,产淀粉酶等，用于甜酒的酿制 生产多种有机酸 转化甾体类物质,产蛋白酶、淀粉酶等，用于腐乳的酿制 生产多种有机酸 转化甾体类物质,毛霉,曲霉,产蛋白酶、淀粉酶等，用于酱油的酿制 生产多种有机酸 产毒素,生产青霉素 纤维素酶和有机酸等 果品腐烂 产生毒素,青霉菌菌丝与曲霉相似，但无足细胞。 分生孢子梗顶端不膨大，无顶囊。 分生孢子小梗多次分枝呈扫帚状。 分生孢子颜色为青绿色。,青霉,四、实验报告,复习显微镜的使用方法，重点放在油镜的使用部分。 严格按照显微镜的使用方法，依次逐个观察细菌的形态、构造及酵母菌、霉菌、放线菌的形态。分别绘出其形态、构造图。,实验五 培养基的制备与灭菌,一、实验背景及目的： 培养基是人工配制的、用于微生物培养的混合基质。 培养基的制备是微生物学实验课程中的基础的实验项目。 有关微生物学的实验工作均开始于相关培养基的制备。 了解微生物培养基及其制备原理和培养基的种类；掌握培养基制备的一般方法和操作步骤。,二、基本原理： 培养基是根据微生物以渗透吸收方式获取营养的特性，人工配制的可以满足微生物生长、繁殖对营养需求的混合养料。 培养基中一般应含有六大营养要素，即碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水。 培养基中的六大营养要素可根据具体的微生物的特性和试验工作的目的要求，决定加入与否。如：培养自生固氮菌时，培养基中就无需加入氮源。,实验五 培养基的制备与灭菌,实验五 培养基的制备与灭菌,在不同的试验工作中，选用不同的培养基，有利于工作的顺利进行。 选用选择性培养基可以从混合有多种微生物的样品中分离出某一种或一类微生物； 选用鉴别性培养基，可以对形态上相似，但属不同种类的微生物做出鉴别、判断； 分离、筛选微生物时，常用固体培养基； 微生物的大规模发酵生产中，常用液体培养基等。,实验五 培养基的制备与灭菌,制备各种培养基的程序大致相同： 1、按照选定的培养基配方，称取各营养物（药品），先用少于总量的水将其溶解（一般需加热，并应不时搅拌，以防烧焦或溢出。配置固体培养基溶解凝固剂时要特别注意此点）； 2、溶解后补足所需水分，调整pH值，分装到合适的容器中； 3、加塞，包扎，标记，及时灭菌。灭菌后，经灭菌效果检验正常即可待用。,实验五 培养基的制备与灭菌,三、实验材料与仪器设备： 1. 根据选定的培养基选用相应的药品（各类营养物）；以常用的分别培养细菌、放线菌和土壤真菌的培养基为例： （1）用于细菌培养的牛肉膏蛋白胨固体培养基（营养琼脂）：属天然培养基。 牛肉膏：3g； 蛋白胨：10g； NaCI：5g； 琼脂：1520g； 蒸馏水：1000mL； pH：7.07.2 。,实验五 培养基的制备与灭菌,（ 2 ）用于放线菌培养的高氏一号固体培养基：属合成培养基。 可溶性淀粉：20g； NaCI：0.5g； KNO3：1g； K2HPO43H2O：0.5g； MgSO47H2O： 0.5g；FeSO47H2O：0.1g； 琼脂：1520g； 水：1000mL； pH：7.47.6。,实验五 培养基的制备与灭菌,（3）用于分离、培养土壤真菌的马丁氏培养基：属选择性合成培养基。 KH2PO4：1g； MgSO47H2O：0.5g； 蛋白胨：5g； 葡萄糖：10g； 孟加拉红：33mg； 琼脂：1520g； 蒸馏水： 1000mL；pH：自然； 临用时，以无菌操作向100mL培养基中加入1%链霉素0.3mL,实验五 培养基的制备与灭菌,四、实验步骤： 1.称量：按培养基配方的要求及配制培养基的总量称取药品（各营养物）置于量杯中； 2.溶解：取少于培养基总量的水于量杯中，加热溶解，不时搅拌；待药品均溶解后，补足水分，调整pH值；,实验五 培养基的制备与灭菌,3.过滤、分装：按要求过滤后（无特殊要求的此步可省略），将配制好的培养基分装到适当的容器中。 试管：液体培养基分装试管的量约为试管高度的1/4左右；半固体培养基约为试管高度的1/3左右；固体培养基约为试管高度的1/5左右； 三角瓶：根据实验的要求分装。做液体培养时，一般在250ml三角瓶中装50100ml或适量的培养基；用于存放固体培养基时，不超过三角瓶容积的1/2；,实验五 培养基的制备与灭菌,4.加（棉）塞：装有培养基的容器均需加塞，其作用是防止杂菌侵入和有利于气体交换。常用自制的棉塞制作方法见下页。做液体培养的三角瓶口使用八层纱布制成的通气塞。 5.包扎：试管每710只捆成一捆，在棉塞上包两层报纸（废报纸应裁成适当的大小），并做好标记！标记内容：培养基名称、制备日期、制作组别等。,实验五 培养基的制备与灭菌,棉塞制作塞方法：,棉塞： A正确 B、C不正确,实验五 培养基的制备与灭菌,6.灭菌：一般培养基采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。高压蒸汽灭菌时应根据培养基的性质采用相应的灭菌温度。 本实验中的牛肉膏蛋白胨固体培养基和高氏一号培养基采用121，灭菌20分钟；马丁氏培养基采用113，灭菌30分钟。,实验五 培养基的制备与灭菌,7.搁置斜面：灭菌完成后，将需要制成斜面的固体培养基试管在未凝固前（约60左右时），斜放在实验台面上，搁置成斜面，斜面的长度约为试管长度的1/2，待凝。 8.灭菌效果检验：培养基冷却后，随机取出少量培养基，置于37培养箱中，24小时，观察有无杂菌生长，无杂菌生长说明灭菌效果良好。贮存，待用。,实验五 培养基的制备与灭菌,五、实验结果： 1、记录你制备的培养基的种类、名称、数量等； 2、实验过程中有何问题，请分析原因。,实验六 微生物的染色,实验目的 染色原理 染色方法 实验材料 实验内容与步骤 注意事项 实验结果,一、实验目的 学习微生物的染色原理、染色的基本操作技术，从而掌握微生物的一般染色法和革兰氏染色法。,二、染色原理 由于微生物细胞含有大量水分，对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大,机体是无色透明的，与周围背景没有明显的反差,在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。 微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成。所以，微生物细胞表现出两性电解质的性质。两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性带正电。在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性带负电。 经测定，细菌等电点pH在2-5之间，故在中性、碱性或偏酸性溶液中，细菌的等电点均低于上述溶液的pH值，所以细菌带负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的较多。微生物体内各结构与染料结合力不同，故可用各种染料分别染微生物的各结构以便观察。,三、染色方法 (一)简单染色法 简单染色法又叫作普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色，如果仅为了在显微镜下看清细菌的形态，用简单染色即可。,(二)复染色法 用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有革兰氏染色法和抗酸性染色法。 革兰氏染色法：不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。,四、实验材料 1.显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯等。 2.石炭酸复红染液、草酸铵结晶紫染液、碘液、95乙醇、蕃红染液 3.菌种：金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌,五、实验内容与步骤 (一)细菌的简单染色步骤 涂片干燥固定染色水洗干燥镜检 1涂片 取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种(金黄色葡萄球菌或枯草杆菌)与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。 2干燥 涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。,3固定 固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过23次，共约23秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60）,放置待冷后，进行染色。 4染色 在涂片薄膜上滴加染色液(石炭酸复红、草酸铵结晶紫或美蓝任选一种)一滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。 5水洗 斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。 6干燥 用吸水纸吸去涂片边缘的水珠，置于室温下自然干燥。用吸水纸时切勿将菌体擦掉。,7镜检 用显微镜观察，并用铅笔绘出细菌形态图。 (二)细菌的革兰氏染色步骤 涂片干燥固定初染水洗媒染水洗脱色水洗复染水洗干燥观察 1取大肠杆菌和枯草杆菌(均以无菌操作)分别做涂片、干燥、固定，方法均与简单染色的相同。 2用草酸铵结晶紫染色1min后水洗。 3加碘液媒染1min后水洗。 4斜置载玻片，滴加95乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色 为止，大约需时2030s，随即水洗。,5用蕃红染液复染1min，水洗。 6用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。绘出细菌的形态图并说明革兰氏染色的结果。,六、注意事项 1革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。因此必须 严格把握脱色时间。 2 选用培养18-24小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。,思考题及实验作业 1 不经复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和阴性菌？ 2 通过革兰氏染色，你认为它在微生物学中有何实践意义？,七、实验结果 简单染色 ： 金黄色葡萄球菌和枯草杆菌染成（ ）色。 革兰氏染色：大肠杆菌与枯草杆菌染色结果填于下表中。,大肠杆菌革兰氏染色,炭疽杆菌的革兰氏染色,革兰氏染色可见大量细菌,革兰氏染色后在显微镜下观察,染色显示革兰氏阴性阳性细菌,微生物的纯种分离、培养 及接种技术,实验七,一、实验目的,通过学习学习微生物的纯种分离，培养和接种技术，进而学会微生物生理生化反应的实验，为废水处理服务。在水处理的细菌检查中，细菌的分离，培养和接种也是一个重要的环节。微生物的纯种分离的方法有两种：稀释平板法和平板划线法。,二、实验器材,1.无菌培养皿（直径90mm），无菌吸管，无菌锥形瓶，无菌试管，5管无菌水（每管有9mL灭菌过的自来水）。 2.营养琼脂培养基（已灭菌的），活性污泥。 3.接种环，酒精灯，恒温箱等。,三、 实验内容,（一）培养基的制备及灭菌 1. 玻璃器皿的包扎与灭菌 （1）六套培养皿一组, 用报纸包装。 （2）取四支吸量管，在其吸端塞少许棉花后用长报纸条包扎。 （3）干热灭菌:上述玻璃器皿在160C烘箱内2小时。 2. 无菌水的制备 在3支试管中各装入9mL自来水，塞上硅胶塞, 同下述培养基一起用高压蒸汽灭菌。,3. 培养基的制备, 称量：牛肉膏 蛋白胨 NaCl 琼脂 自来水 0.75g 1.5g 0.75g 3g 150mL 溶化：用烧杯在电炉上将上述各物依次溶解，注意补充水。 调pH值： 溶液稍冷后用pH试纸、10% NaOH或10%HCl 调整溶液 的 pH在7.6左右。 分装：试管4支各装其高度1/5的溶液，其余溶液装锥形瓶。 加塞包扎：锥形瓶加棉塞并用牛皮纸包扎。 湿热灭菌 ：（高压蒸汽灭菌）1.05kg/cm2(103kPa)、 121灭菌 20min。 搁置斜面： 试管培养基冷至50时斜搁使斜面长度不 超过试管一半。,（二）微生物的分离、培养及形态观察,1. 平板划线分离法,(1) 倒平板: 将融化并冷至50的细菌培养基倒约1520mL于无菌培养皿中，立即放在桌上轻轻转动使之均匀。冷后成平板。（3个） (2) 划线：在火焰旁，左手拿平板，右手拿接种环，取一环菌液（原污水）在平板上划线。常用划线方法见下图。 划线完毕后 盖上皿盖，倒置 于37恒温箱中 培养48小时后观 察结果。,2. 稀释平板分离法 (1) 取样 (2) 稀释水样 以无菌操作按十倍稀释法用无菌吸量管和无菌水将10-3倍的水样稀释至10-4、10-5、10-6倍。 (3) 平板制作 将三套无菌培养皿编号，将上述三种浓度的水样各吸0.5mL 于相应的培养皿中。加热融化培养基，待其冷至约45时以无菌操作倾注1015mL 入培 养皿中，马上将培养皿平 放桌上 轻轻转 动使之混合均匀， 冷却后 成平板。 倒置，于 37培 养48小时后观察 结果。,10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6,（三）其他一些接种的操作技术 1斜面接种技术 2液体接种 3由液体培养基接种到液体培养基 4穿刺接种,四、思考题,1、 分离活性污泥为什么要稀释水样？你考虑怎样来进行生物膜法生物膜的纯种分离和培养？ 2、 用一根无菌吸管取几种浓度的水样时，应从哪一个浓度开始？为什么？,实验八 纯培养菌种的菌体、 菌落形态观察,一、实验目的要求,1、观察细菌、放线菌、酵母菌、霉物具体菌种菌落的形态特征。 2、总结几类微生物菌落的一般特征并能识别。,二、在固体培养基上形成的菌落的特征,菌落：单个菌体在固体平面培养基上生长繁殖形成的肉眼可见的群体。,区分和识别各类微生物可从菌落形态（群体形态）和细胞形态（个体形态）两方面进行，菌落形态是无数细胞形态的集中反映，因此，每一大类微生物都有其一定的菌落特征，可通过这些特征差异区分和识别之。 特征描述：形状、大小、颜色、边缘、隆起、光泽、质地等。,细菌菌落特征：凝胶状、表面较光滑、湿润、与培养基结合不紧密，易挑取，正反颜色一致。,观察溶血现象（完全溶血、半溶血及不溶血）,示教：血平板上细菌的生长现象,放线菌特征：致密、坚硬、多皱、不易用针挑起，不透明。孢子成熟后，表面粉末状，干燥。,酵母菌菌落特征：与细菌相似，但比细菌大而厚，不透明，表面光滑、湿润、粘稠，易用针挑起，多呈乳白色。,霉菌的菌落特征：比细菌菌落大，由菌丝组成疏松的绒毛状、絮状或蜘蛛网状，有的无固定大小，延至整个培养基中，产色素，使菌落显色。,三、斜面培养基上生长状态,可见有均匀一致的菌苔，如有不同的菌落出现，则表明污染了杂菌。,四、液体培养基中生长状态,培养前的液体培养基多为清彻透明的。接种细菌后，由于细菌种类不同，可有以下三种生长形式。 均匀混浊生长：液体变为混浊。 表面生长：液体澄清，表面有一薄膜。 沉淀生长：管底有沉淀物。,示教：菌膜，混浊，沉淀,表面生长,沉淀生长,混浊生长,液体培养基,五、半固体中生长状态,动力阴性（无鞭毛）的细菌在半固体培养基中生长，只能沿着接种线生长，因此生长线清晰；动力阳性（有鞭毛）的细菌在半固体培养基中生长，可扩散生长，因此生长线模糊，呈羽毛状。,半固体培养基：,六、结果记录,1、借助放大镜分别观察各类微生物的菌落的大小，表面粗糙及含水分状况，边缘，致密程度、透明程度，及厚度等特征，并填写记录表。 2、根据观察结果总结各类微生物菌落的一般特征。,微生物菌落观察记录表,实验目的 实验用具 培养基及染色试剂 水样的采集和保存 实验方法及步骤 思考题,实验九 微生物的生理生化特性,一、实验目的 在水处理工程中，水源水要经过处理后才能供给用户。饮用水要求清澈、无色、无臭，更重要的是没有病原菌。因此，自来水在出厂以前要作水质的物理化学分析和细菌检验，本实验结合给水净化工程中的细菌检验，作细菌总数和大肠菌群的测定。通过大肠菌群的测定，了解大肠杆菌的生理生化特性。 大肠菌群数系指每升水样中所含有的大肠菌群的数目。大肠菌数一般包括大肠埃希氏杆菌、产气杆菌、枸椽酸盐杆菌和副大肠杆菌。本实验的发酵试验采用含有乳糖的培养基，故测定结果不包括副大肠杆菌。 细菌总数是指1mL水样在营养琼脂培养基中，于37C经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数(实际上所表示的是腐生细菌的数目。腐生细菌在营养琼脂培养基上所形成的菌落呈白色细点状)。 我国现行生活饮用水卫生标准GB574985规定：细菌总数是指1mL水中不得超过100个，大肠菌群1L水中不得超过3个。,1水样瓶； 2吸管、试管、锥形瓶等；3稀释瓶； 4培养皿(平皿)； 5发酵管和发酵瓶； 6接种环； 7细菌滤器； 8滤膜； 9高压蒸汽灭菌器； l0恒温箱(培养箱)； 11电冰箱； 12显微镜； 13镜油(香柏油)、二甲苯、擦镜纸等； 14普通放大镜； 15pH电位计(或氢离子浓度比色计或pH精密试纸)。,二、实验用具,三、培养基及染色试剂,本实验所需培养基及染色试剂有如下几种： 1、营养琼脂培养基：供细菌总数测定用 2、乳糖蛋白胨培养基：供大肠菌群检验“发酵法”用 3、浓乳糖蛋白胨培养基：供大肠菌群检验“发酵法”用 4、伊红美蓝培养基：供大肠菌群检验“发酵法”用 5、革兰氏染色剂：供大肠菌群检验用,四、水样的采集和保存,用于细菌检验之水样较化学分析所用的尤应谨慎采取。所取水样必须要保证其代表性。并在收集和保存时不得有所污染，瓶中水样不应完全装满，以便于检验前能彻底摇匀。采集水样的容器，可用清洁硬质玻璃瓶。容器必须经高压灭菌，保证无菌。并需保证水样在运送、保存过程中不受污染。 如要从河湖或井水中取水，可用特制的采样器。取样前应对玻璃瓶先作灭菌处理。采集时将采样器浸入水中，使采样瓶口位于水面下10-15cm深处。然后拉开瓶塞，使水进入瓶中。水样采集后，应将水样瓶中水样倒入无菌储样玻璃瓶中，或将水样瓶取出，立即用无菌棉塞塞好瓶口，以备检查。,采取自来水水样时，须先冲洗龙头，再用酒精棉烧灼灭菌，然后放水5-10min，接着将瓶移上取水。 采取含有余氯的水样时，应在水样瓶未检验前接500mL水样加入1.5硫代硫酸钠溶液2mL，以消除氯的作用。 水样采集和分析的间隔时间应尽可能缩短。水样采取与检验相隔时间应在4h内。 取样时要将取样日期、温度、水的来源、环境状况、水的用途等注明。,五、实验方法及步骤,原理：发酵法是根据大肠菌群能发酵某些糖类而产酸产气等特性来进行检验的。 步骤：(1)水样稀释 (2)初发酵试验: 以无菌操作的方法，用无菌移液管吸取1mL1:100和l:10的稀释水样以及1mL原水样，分别注入装有10mL乳糖蛋白胨培养基的发酵管中，另取10mL原水样，注入装有5mL三倍浓乳糖蛋白胨培养基的发酵管中，置37恒温箱中培养18-24h后观察结果。 情况分析：如无气体和酸产生，则为阴性反应，表示无大肠菌群存在；如有气体和酸产生，或虽无气体产生，但有酸形成，则为阳性反应，表示此水可能为粪便污染，需作进一步的检验；如有气体形成，但没有产酸，溶液也不浑浊，则操作技术上有问题，须重作检验。,(一)大肠菌群的检验（水源水，发酵法）,(3)平板分离：用无菌接种环，从前一阶段所需进一步检验的发酵管中沾取菌液，在伊红美蓝培养基上划线。然后将培养皿置于37恒温箱内培养18-24h，记录其结果如下： 1)如无细菌增殖现象，可认为是阴性反应，无大肠菌群存在。 2)如仅发现芒状、霉状或其它无关菌属的菌落，则表示无粪便性的污染。 3)如发现有下列特征的菌落，则应取菌落的一小部分进行涂片、革兰氏染色、镜检。如涂片中没有革兰氏阴性的杆菌，则表示无大肠菌群存在；如涂片中有革兰氏阴性无芽孢的杆菌时，则进行复发酵试验。,(4)复发酵试验：用无菌接种环挑取上述涂片镜检显示革兰氏阴性无芽孢杆菌的菌落的另一部分接种于已灭菌的装有10mL普通浓度乳糖蛋白胨培养基的小发酵管(内有倒管)中，每管可接种分离自同一初发酵管或发酵瓶的最典型的菌落1-3个，然后置于37恒温箱中培养18-24h，有产酸产气者(不论倒管内气体多少皆作为产气论)，即证实大肠菌群存在。,水样接种,阳性管,大肠菌群的检验步骤方框图：,原理：本试验采用标准平皿法对水样中细菌作计数，这是测定水中好氧和兼性厌氧异养细菌密度的方法。由于细菌在水体个能以单独个体、成对、链状、成簇或成团的形式存在，此外没有单独的一种培养基或其一环境条件能满足一个水样中所有细菌的生理要求，所以由此法所得的菌落数实际上要低于被测水样中真正存在的活细菌的数目。,(二)细菌总数的测定 （水源水，倾倒法）,制作培养基平板,定量接种水样,37下培养1824h,计数菌落,倾倒法,步骤：(1)水样稀释。(2)根据水样的洁净程度，污染严重者选取10-2、10-3、10-4三个连续稀释度，中等的选取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度。稀释度的选择是本试验精确度的关键，选择适宜者，平皿上菌落总数介于30和300之间。(3)吸取由高倍至低倍的稀释液，每个稀释液分别注入两个培养皿，每皿1mL。注入彻底融化，然后冷却到45的营养琼脂培养基约15mL，立即旋摇培养皿，充分混匀。方法是握住平皿，先往一个方向画圆，再朝相反方向回转；或一面画圆，一面适当倾斜。小心勿使这个混合液体溅到培养皿的边缘。让平皿培养基于水平位置放置至固化后倒置于37生化箱中培养18-24h，观察结果。,菌落计数及报告方法：作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用。而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀。则可将此平皿计数后乘 2 以代表全皿菌落数。,各种不同情况的计算方法 ： (1)首先选择平均菌群数在30-300之间者进行计算。当只有一个稀释度的平均菌落符合此范围时，则即以该平均菌落数乘其稀释倍数报告之。 (2)若有两个稀释度，其平均菌落数均在30-300之间，则应按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2应报告两者的平均数，若大于2则报告其中较小的菌落总数。 (3)若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。 (4)若所有稀释度的平均菌落数均小于300，则应按稀释度最低的平均茵落数乘以稀释倍数报告之。 (5)若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。,六、思考题,1、测定大肠菌群数说明什么问题？为什么要用 大肠菌群作检验指标? 2、测定细菌总数说明些什么? 3、为什么乳糖蛋白胨培养基用0.7kg/cm2 灭菌，而不用1kg/cm2 20mi？ 4、作了细菌检验，为什么自来水厂还要经常进行余氯的测定? 5、根据我国饮用水水质标准，讨论这次检验的结果？,一、目的与要求 1、掌握藻类形态特征及观察方法。 2、认识藻类及其主要门的主要特征，并了解藻类 在系统分类中的进化地位。,实验十 藻类形态观察,二、材料和用品 1、自备材料： 地木耳、水绵、紫菜、海带、轮藻、平菇或磨菇新鲜标本或市售干品；根霉、酵母菌、青霉、曲霉的培养材料； 2、其它材料和用品：上述材料的显微制片、发网菌变形体永久制片、 发网菌孢子囊永久制片、硅藻制片；蘑菇、 猴头、灵芝、 鬼伞、