体内药物分析第三章生物样品与样品制备.ppt

1,第三章 生物样品与样品制备,药学院药物分析教研室,2,【大纲要求】,1、掌握生物样品的种类及其特点 2、掌握生物样品的各种预处理方法的原理及其应用,3,第一节 生物样品的种类、采集、制备与贮存,4,一、种类、采集和制备,(一) 血液(Whole blood, Plasma, Serum) 1、血样采集 2、血样制备 血浆的制备 血液含有抗凝剂的试管混合 2500rmin3000rmin离心5min 上清液即为血浆。 血清的制备 血样室温放置30min到1h 出现血饼剥去血饼以2000r/min3000r/min离心5min10min 分取上清液即为血清,不能作为作用部位药物浓度的可靠指标,当血浆中含有的抗凝剂对药物浓度有干扰时，使用血清样品,5,肝素的加入： 1ml血液/需要肝素0.10.2mg，通常不需准确加入，在取血前可取少量肝素钠溶液（12滴）置于试管内，旋转试管，使肝素溶液均匀分布于试管壁上，干燥后加入血样后立即轻轻振摇即可。,6,全血：血液置于抗凝管中，不经离心操作，冷冻储存或直接分析 需要测定分布于血细胞内、外的药物浓度 如果血浆内药物浓度波动较大并难以控制 血浆药物浓度很低凝影响测定 血样的特点： 缺点：损伤性采样方式、样品量受限、抽血比较麻烦 优点：可用于药物动力学、生物利用度、临床治疗药物监测 大多数测定的时原型药物总量,7,(二) 尿液 1、尿药测定用途：药物剂量回收研究、药物尿清除率、生物利用度、判断患者用药是否遵医嘱、预测药物的代谢过程和代谢类型 2、尿的采集：非损伤性采样方式、药物浓度较高、收集量较大、收集方便，易受食物、饮水等影响。 3、尿样的保存与处理：,8,(三)唾液 1、唾液的采集：漱口后15min进行，采集时间为10min，采用一些物理或化学方法刺激唾液分泌；（1）缩短采样时间，（2）减小唾液pH变化范围，（3）刺激后得到的唾液其唾液血浆分布比例的个体差异较小。 2、唾液的保存与处理：取样后，除去泡沫，分层后离心，取上清液冻存或直接分析。 3、优点：（1）非损伤性取样，（2）可用于药代动力学研究，（3）不受采血时间和地点限制，（4）样品易收集，病人易接受 4、应用：（1）在TDM中的应用 根据S/P分类，S/P1.0表示药物在唾液中的浓度很低；S/P1.0表示适合药物的监测；S/P不固定表示药物显著转移到了唾液中；S/P很大表示药物的离子化程度很低 （2）药代动力学参数的测定,9,组 织 （1）匀浆化法：组织加入水或缓冲液匀浆上清液 （2）沉淀蛋白法：组织加入蛋白沉淀剂上清液 （3）水解：组织加入酸或碱加热使组织液化上清液 （4）酶水解：组织加入酶和缓冲液加热使组织液化上清液,10,头 发 优点：取样方便、无损伤性、检样的掺伪的可能性低、能对某些特定的代谢物进行测定、能了解数月至数年用药的情况、可用于体内微量元素含量测定、可用于临床用药、滥用药物和毒性药物的检测 缺点：样品的预处理繁琐、干扰多、药物的含量低、需要精密仪器,11,特点： 广谱性 积累性 稳定性 依时性 相关性 指纹性,一般在枕部采取样本，国外一般在靠近头皮处剪取，分别于610处取10个样本，从根部剪断，超过12cm的均按照12cm处剪断,12,头发洗涤,1、丙酮水丙酮 2、丙酮预洗洗洁精洗涤 3、洗衣粉浸泡 4、二氯甲烷 5、SDS洗涤 6、甲醇,头发的预洗,都需要反复清洗23次,13,毛发样品的制备,1、直接甲醇提取 2、酸水解 3、碱水解 4、酶水解 5、超临界流体萃取 6、有机破坏,14,二、生物样品的贮存与处理,（一）冷藏或冷冻 1、血浆和血清：采血后及时分离（2h），短期4，长期-20 2、尿样：应立即测定，否则需加防腐剂置冰箱保存 3、唾液：在4下保存，往往需要在取样时测定pH值 4、生物样品总的原则：临时解冻，解冻的样品一次测完，不能反复冷冻解冻冷冻(FTC)；样品应以小体积分装存放。,15,第二节 生物样品的预处理与制备,16,一、预处理目的,（一）药物从缀合物中释放，测定总浓度 （二）纯化、富集药物 （三）适应和满足测定方法要求的灵敏度 （四）防止对分析仪器的污染和劣化,17,二、样品制备时应考虑的问题,（一）药物的理化性质、存在形式和浓度范围 （二）药物测定的目的 （三）生物样品种类和杂质干扰类型 （四）样品的化学组成 （五）药物的蛋白结合率 （六）被测组分在预处理过程中的稳定性 （七）样品在收集、储存等过程中容器的污染 （八）样品的预处理过程要求简便 （九）预处理的最后一步应富集被测组分 （十）对分析方法的要求,18,19,三、样品的预处理技术,（一）经有机破坏的方法 1、湿法破坏 2、干法破坏 硝酸高氯酸法 高温电阻炉灰化法 电热消化器法 低温等离子灰化法 电热板消化法 烘箱消化法 3、氧瓶燃烧法,20,（二） 去除蛋白质,1、溶剂解法 常用溶剂（与水相混溶的有机溶剂）： 乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、 丙酮、四氢呋喃 体积比：1：13 90去除 方法：超速离心（10000r/min）,21,22,（二） 去除蛋白质,2、加入中性盐 常用中性盐（置换蛋白结合的水，使蛋白脱水而沉淀）： 饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐、枸橼酸盐 比例：1：2 90去除 方法：超速离心（10000r/min）,23,（二） 去除蛋白质,3、加入强酸 常用溶剂（与蛋白质阳离子形成不溶性盐沉淀）：10三氯醋酸、6高氯酸、硫酸钨酸混合液、5偏磷酸 体积比：1：0.6 90去除 方法：超速离心（10000r/min）,24,25,其他去除蛋白的一些方法 1、加入含锌盐及铜盐的沉淀剂 2、超滤法 3、酶水解法 4、加热法,26,（三） 分离、纯化与浓集,1、液液提取法（LLE） 2、固相萃取（SPE） 3、自动化SPE技术 4、固相微萃取（SPME） 5、膜萃取（ME） 6、微透析技术（MD） 7、超临界流体萃取（SFE）,27,1、液液提取法（LLE）,大多数药物都是脂溶性的，内源性物质基本上都是水溶性的，当用有机溶剂萃取时，药物被萃取出来而内源性物质被除去，因此采用有机溶剂萃取法能够达到纯化的目的。,28,关键要考虑三个方面的因素： （1）有机溶剂的特性 （2）有机溶剂相和水相的体积 （3）水相的pH值,29,选择溶剂应注意的问题： （1）了解药物与溶剂的化学结构及性质，根据相似相溶来选择 （2）要求对分子型药物易溶，离子型药物不溶 （3）沸点低、易挥发和浓缩 （4）要与水不相溶 （5）无毒、不易燃 （6）不易乳化 （7）具有较高的化学稳定性和惰性 （8）不影响检测,溶剂的选择与纯度要求,30,2、有机相和水相的体积：一般为1:11:2 3、水相的pH值：碱性药物pHpKa+12 酸性药物pHpKa+12 4、提取次数：往往进行的是一次萃取，个别情况下可以对分离出的含药有机相用一定的pH水进行反萃取（Back extraction),31,优点：选择性；药物能与多数内源性物质分离 缺点：乳化、有毒、不环保、不自动，对极性大的化合物的萃取效率低 总的流程图：,血浆或其他生物样品,加入萃取溶剂,分取有机层,必要时调pH值,减压氮气吹干,流动相溶解后进样分析,32,消除LLE中产生的乳化现象： 1、提取前在水相中加入适量的固体食盐 2、经适当转速离心消除已产生的轻微乳化 3、置于冰箱中快速冻凝破坏乳化层，再融化后离心来消除已产生的严重乳化现象,33,LLE的两种特殊萃取方法： 离子对提取法（Ion-pair extraction) 提取烷基法（Extractive alkylation）,离子对提取法：是一种用有机溶剂提取离子型药物的方法。 原理：一些酸性或碱性的有机药物在体液中呈离子状态，成为强亲水性的带电荷离子，不易被提取出来。当加入与药物呈相反电荷的反离子物质时，即可成为具有一定脂溶性的离子对，用有机溶剂可萃取出来。,34,碱性药物：庚烷磺酸、辛烷磺酸、己烷磺酸等 酸性药物：四丁基铵、四乙基铵、四辛基铵 提取溶剂：氯仿、二氯甲烷,35,2、固相萃取( Solid phase extraction, SPE) （1）原理 根据液相萃取的原理，利用液相中溶质与吸附剂间的选择性吸附与洗脱原理。当液相流经吸附剂后，一些小分子药物被吸附，经适当洗涤除去杂质，再用少量溶剂洗脱，可达到分离、纯化目的。 决定因素：药物与固定相表面的活性基团、药物与溶剂分子间的分子间作用力,36,洗脱方式： （1）药物与固定相的亲和力杂质与固定相的亲和力先被保留后解吸 （2）药物与固定相的亲和力杂质与固定相的亲和力直接洗脱,37,可弃性柱、操作步骤少、使用溶剂少、节省实验费用和时间,38,（2）SPE固相选择的原则固定相与被测组分应具有相似的极性，含有被测组分的样品应使用极性相反的溶剂溶解后上柱，而用与被测组分相似极性的溶剂洗脱 亲脂性键合相硅胶（C18、反相硅胶） 大孔吸附树脂（苯乙烯与二乙烯苯共聚物） 离子交换树脂 亲水型填料（硅藻土、正向硅胶）,39,40,（3）SPE方法建立以亲脂性键合硅胶为例 1、以甲醇润湿小柱，活化填料，甲醇含量8 2、用水或缓冲液冲洗小柱，洗去多余的甲醇 3、上样，弃去废液 4、用水或缓冲液冲洗小柱除去水溶性杂质 5、用合适的洗脱剂洗脱小柱，收集洗脱物 6、回收溶剂后进行分析和监测,41,实验中的注意事项,1、体液样品可直接上柱，上样体积在0.12.0ml 2、洗脱流速在12ml/min 3、萃取介质中含有少量的甲醇可以提高萃取率 4、萃取碱性药物时，常需在洗脱机中加酸、有机胺、醋酸铵或离子对试剂 5、选用苯基和氰基柱时，需用极性溶剂如丙酮洗脱 6、选用反相硅胶柱时，少量的甲醇和乙腈即可完成洗脱,42,：大孔吸附树脂,特点：具有较大的比表面积、吸附容量大、可反复使用、价格便宜、最常用的是非极性、一般用乙醇水或甲醇水即可解吸待测物质、加入适量的无机盐有助于吸附 预处理：用乙醇浸泡除去杂质（或用酸碱泡），并使其充分溶涨，在用水洗去有机溶剂后使用。 注意事项：树脂要保持湿润,43,：离子交换树脂,1、对弱酸性药物在中性或碱性条件下用阴离子交换法萃取用水或甲醇清洗酸性溶液洗脱 2、对碱性药物在中性或酸性条件下用阳离子交换法萃取用水或甲醇清洗碱性溶液洗脱 离子交换树脂适用于高极性和可电离性药物的纯化,44,：亲水性填料,原理：分配作用，水基质样品分布于填料表面为固定相，流动相为与水不相混溶的有机溶剂，较为亲脂的药物从固定相转移到流动相就完成了萃取，与LLE雷同。 操作：上样到亲水性固定相表面用与水不相混溶的有机溶剂洗脱目标化合物强亲水的蛋白质等保留在固定相上。 注意事项： 1、硅胶填料先用甲醇和水处理后上样 2、硅藻土/棉纤维直接上样，不需清洗并可再生 3、样品萃取无浓集作用，萃取体积大，样品较干净,45,萃取方法的选择,1、亲脂性药物LLE、反相硅胶、大孔吸附树脂、亲水性填料 2、碱性药物（亲脂性）大孔吸附树脂 3、亲水性强可离解的药物离子交换树脂 4、亲水性强不可离解的药物沉淀蛋白后进样,46,（4） 各萃取方法之间的比较,SPE方法间的比较,47,SPE方法的优点： 1、引入的杂质少 2、可以完全避免乳化的形成 3、有较高的萃取回收率，重现性好 4、小柱可弃，没有污染 5、需要的样品量少 6、洗脱溶剂多为水溶性的，易于实现自动化,48,SPE的缺点： 1、价格昂贵 2、技术要求高 3、小柱各批之间有差异 4、主子容易堵塞，影响分离效果,49,SPE与LLE即沉淀蛋白的比较 1、SPE萃取时间短，可自动化 2、LLE萃取达平衡的时间较长 3、二者在萃取回收率即选择性等方面，因药物与萃取条件而变，不好比较 4、沉淀蛋白法简便、快速、回收率高，但不适合于含量低的样品 5、三种方法得到的都是药物的总量,3、自动化SPE技术,50,自动化SPE技术的优点和缺点,（1）节约时间 （2）平行操作带来了高的工作效率 （3）减少了操作误差，提高准确度和精确度 （4）安全性好,优点,缺点,（1）残留物对测定有干扰 （2）要考虑样品的物理或化学性质的稳定性对样品测定的影响,51,自动化设备,在线技术（On-line technique) 独立柱工作站（Discrete column workstation) 96通道工作站（96-well stations）,52,在线提取技术,（1）限制性介质填料（Restricted access media RAM） （2）湍流色谱（Turbulent flow chromatography （3）在线固相萃取技术,53,限制性介质填料：是一种直接进样预处理技术，通过控制硅胶微粒孔径的大小及表面结构来分离待测药物。 由亲水性的外表面和疏水性的内表面构成的孔径适宜的硅胶颗粒，大分子不能进入孔的内部，不能在柱上保留。,54,湍流色谱：是一种直接进样预处理技术，采用510ml/min的高流速，形成非线性的液流，加快待测物在吸附剂上的分布速度，使得大分子的生物基质成分与小分子药物得到良好分离 在线固相萃取技术：是应用最广泛的一种预处理技术，常与HPLC和LC-MS/MS联用,55,56,Fluvastatin,57,Blank plasma,Plasma spiked with standard,Plasma obtained after oral administration,58,自动处理108个样品，同时平行进行四个样品的固相萃取 高处理量，适合LC-MS及GC 使用1 ml和3ml、6ml 标准SPE柱 处理后的样品可转移至普通试管、密封的标准2ml自动进样瓶以及96孔反应板 可在440范围控制温度 可进行双柱串联的自动固相萃取,59,自动化SPE方法的建立 （1）柱预处理：除去填料中的杂质，使填料溶剂化，提高重现性 （2）加样：注意样品溶剂强度不宜过高、样品体积要小 （3）除杂：用中等强度的清洗溶剂洗脱干扰组分，不影响待测组分的保留 （4）待测物的洗脱和分析：用解析溶剂完全洗脱待测物,60,自动化SPE方法学评价,（1）样品回收率 （2）精密度 （3）灵敏度,61,Sensitive liquid chromatographytandem mass spectrometry method for the determination of scutellarin in human plasma: Application to a pharmacokinetic study,62,63,4、固相微萃取法（Solid-phase micro- extraction SPME） 最先由加拿大Waterloo大学的Pawliszyn教授的研究小组于1990年首次进行开发研究,属于非溶剂型选择性萃取法。SPME已由美国的Supelco公司在1994年实现商品化,64,（1）装置,65,（2）方法 萃取过程:将萃取器针头插入样品瓶内使具有吸附涂层的萃取纤维进行萃取拉起活塞拔出针头 Direct-SPME:是将纤维直接插入样品溶液中进行萃取, 达到分配平衡后即可取出进行色谱分析。 Headspace-SPME:不是直接将纤维插入溶液中而是在液上进行顶空萃取, 不与样品接触，可避免基体干扰和提高分析速度。,66,67,解吸过程 SPMEGC 解吸方式通常为热解吸，解吸温度一般为150250，气相的载气流也有助于解吸。整个过程实现了无溶剂化，提高了柱效，减轻了环境污染。 在SPMEHPLC中，通常要采用六通阀装置，使待测物在适当的溶剂中解吸（称之为溶剂解吸），并将待测物带入检测器。选择适当的洗脱剂和洗脱时间可避免峰展宽。,68,原理：,n萃取涂层中所吸附的待测物的量 Ks1待测物在涂层和样品基质间的分配系数 Vs萃取头固定相液膜的体积 V样品溶液的体积 C0待测物浓度,当V远大于Ks1Vs时,萃取头固定相的类型、增加纤维长度和涂层厚度,69,SPME的影响因素：,（1）纤维涂层相似相容原理（极性涂层萃取极性化合物、非极性涂层萃取非极性化合物），小分子和挥发性物质（100m），大分子或半挥发性物质（7m） 聚二甲基硅氧烷（PDMS）非极性涂层 聚丙烯酸酯（PARL）极性涂层 结合方式：非键合、键合、部分交联 三者在有机溶剂中的稳定性：键合相部分交联非键合相,70,（2）萃取时间：不要求达到完全的萃取或平衡，萃取时间一般为520min，应保持采样时间、温度和纤维侵入的深度等条件一致 （3）涂层厚度及其性质：涂层厚有利于提高方法灵敏度、适合于挥发性物质的保留、吸附速度慢、达平衡时间长、分析速度慢 （4）盐的作用和pH的影响：水溶液中离子强度增大，提高分析灵敏度，样品液的pH值应与涂层的一致 （5）搅拌的影响：可提高分析灵敏度，机械搅拌效率高 （6）温度的影响：升高温度缩短平衡时间，加快分析速度，但会使待测物的分配系数减小，不利于分配,71,（5）联用技术,72,SPME在体内药物分析中的应用： 优点：操作时间短，样品量小，无萃取溶剂，重现性好，选择性高，适合于极性和非极性化合物的样品前处理，集采样、萃取、浓集、进样于一体，避免过多的操作误差，还可与GC、HPLC等仪器联用。 展望：发展高选择性和高效涂层的新型填料，使分析对象扩展到无机物的分析,73,5、膜萃取（Membrance extraction ),（1）原理：膜是两相间的选择性屏障，在膜两侧施加一定的动力时，物质就会从一侧迁移到另一测。分子足够小，能通过膜，大分子则不能通过膜。 浓度梯度导致分子迁移 电位梯度导致电荷迁移 压力梯度导致气体或松密度液体迁移 材料：聚丙烯、纤维素、人造膜、生物屏障,74,（2）膜的几种萃取方法 1、微粒填料薄膜（Particle-loaded membrance PLM）：是由各种不同的固定相填料填充于薄膜介质中构成的，C8、C18、SDB等，多孔网状聚四氟乙烯、聚氯乙烯等，厚度约为0.55mm。 优点：提取效率高，单位体积的提取容量大，洗脱溶剂用量小，提高分析灵敏度，可多层堆叠，提高分析容量和选择性，不同的填料可同时堆叠，可同时富集不同类型和酸碱性的化合物。 注意事项：样品液应先经过0.10.2m的滤膜过滤，防止堵塞，加样前需用少量甲醇润湿,75,2、支持液膜萃取（Supported liquid membrance extraction SLME） 采用一层渗透性聚四氟乙烯膜分开两种溶液，薄膜中的微孔由溶剂饱和后固定在两个扁平的模块之间，呈现上下两水相层，中间有机层的“三明治”三相萃取系统，即“液液萃取透析液液萃取”三步的结合。一般来说，待测物在样品中呈离子状态与另一试剂形成非离子状态，被有机膜萃取厚扩散进入接受相，完成萃取过程。 适用于强极性化合物，非极性和无法离子化的药物不能选用该法,76,3、微孔滤膜液液萃取（Microporous membrance liquid-liquid extraction MMLLE） 基本原理同支持液膜萃取，将“三明治式”改为两相萃取，用一张疏水性膜将水相与有机相隔开，水相流速快而有机相流速慢，适合于微量弱极性化合物的富集和纯化。,77,膜萃取的特点： 不仅可以实现样品的分离、高选择性、有机溶剂用量小，可以与GC在线联用，易于实现自动化 影响因素： 样品液的流速 联用技术： 可与LC、GC、CE联用 展望： 商品化的膜分离设备的出现,78,6、微透析技术（Microdialysis MD）,是一种膜分离技术，它是利用膜透析原理，微量地对细胞液进行流动性连续采样的新型采样和色谱样品制备技术；也可解释为是一种在不破坏生物体内环境的前提下，对生物体细胞液的内源性或外源性物质进行连续取样和分析的新技术。 可进行原位分析（In site analysis）,79,原理：将由膜制成的微透析探针植于需要取样的部位，用与细胞间液相接近的生理溶液在0.55l/min的流速灌注探针，由膜内外的浓度差使体内待测组分被灌注液带到体外，进行分析。 装置：微透析探针、并可与CE和微柱HPLC联用,80,微透析技术的特点： 1、可连续跟踪体内多种化合物的量随时间的变化时间分辨性 2、空间分辨性可真实代表取样点化合物的浓度，在不同部位取样，可以知道药物的分布 3、可以直接提取出不含大分子的小分子药物 4、样品不经处理可直接测定 5、在药物代谢中，不需处死动物和制备匀浆，可完整提供每只动物的浓度时间曲线，减少实验动物数，不破坏机体完整性，可维持实际的生理条件。,81,微透析技术的分析方法： 1、对分析方法的要求：高灵敏度、样品量少、分析速度快 2、微透析与HPLC在线联用：反相或离子交换LC 3、微透析与HPCE在线联用：需要利用一种缓冲液将背景电介质稀释后进样分析,82,微透析技术的应用： 1、药物代谢动力学的研究：外周（皮肤、脂肪组织）、血液、胆汁、肝脏、肾脏、眼睛、骨骼肌等 2、研究药物向中枢神经系统的分布 3、药物与蛋白的结合研究,83,7、超临界流体萃取（Supercritical fluid extraction SFE）,基本概念 1、超临界流体（SF）是指处于临界温度和临界压力以上，介于气体和液体之间的流体。氨、乙烷、庚烷、一氧化亚氮、二氧化碳，具有液体和气体的双重特点，具有与液体相似的密度和溶解能力，具有与气体形似的黏度 选择C02为SF的原因：具有较低的临界温度（31）和临界压力（7390kPa）、惰性、无毒、无味、无色、不易燃、价格低廉 2、超临界流体萃取：是指利用超临界状态下的气体作为萃取介质进行药物萃取的一种方法,84,超临界流体C02的溶解能力：非极性或低极性化合物，入挥发油、酯、醚、内酯等。中等极性或大极性的化合物在较低的萃取压力下不能被萃取，往往需要加入Modifier。,85,超临界流体萃取的影响因素 1、温度温度高利于萃取，但要考虑样品的稳定性 2、萃取压力高的萃取压力利于萃取，但应考虑仪器的性能 3、改性剂加入少量的改性