GB-T4789.6-2003食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验.pdf

I C S 0 7 . 1 0 0 . 3 0C 5 3中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B / T 4 7 8 9 . 6 -2 0 0 3 代替 G B / T 4 7 8 9 . 6 - - 1 9 9 4食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验Mi c r o b i o l o g i c a l e x a mi n a t i o n o f f o o d h y g i e n e -E x a mi n a t i o n o f d i a r r h e o g e n i c E s c h e r i c h i a c o i i2 0 0 3 - 0 8 - 1 1 发布2 0 0 4 - 0 1 - 0 1实施中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部六中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t )免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 4 7 8 9 . 6 -2 0 0 3o il青本标准对G B / T 4 7 8 9 . 6 -1 9 9 4 食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验 进行修订。本标准与 G B / T 4 7 8 9 . 6 -1 9 9 4 相比主要修改如下：按照 G B / T 1 . 1 -2 0 0 0 对标准文本的格式和文字进行修改。 一 修改并规范原标准中的“ 设备和材料” 。本标准自实施之 日 起， G B / T 4 7 8 9 . 6 - - - 1 9 9 4 同时废止。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准起草单位： 江西省卫生防疫站、 中国疾病预防控制中心营养与 食品安全所。本标准主要起草人： 何晓青 、 冉陆、 付萍、 姚景会。本标准于 1 9 8 4 年 首 次发布， 1 9 9 4 年第一次修订， 本次为第二次修订。免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t )免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载GB / T 4 7 8 9 . 6 -2 0 0 3食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验范 围本标准规定 了食品中致泻大肠埃希氏菌的检验方法。本标准适用于食品和食物中毒样品中致泻大肠埃希氏菌的检验 。2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注 日期的引用文件 ， 其随后所有的修改单（ 不包括勘误的内容） 或修订版均不适用于本标准， 然而， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注 日期的引用文件， 其最新版本适用于本标准。 G B / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3 食品卫生微生物学检验染色法、 培养基和试剂设 备和材 料3 . 1 冰箱 ： 0 C-4 0C。3 . 2 恒温培养箱 ： 3 6 士1 0C, 4 2 0C。3 . 3 恒温水浴锅： 1 0 0 00, 6 5 0 C -6 8 C, 5 0 0 C。3 . 4 显微镜 ： l o x-1 0 0 X。3 . 5 离心机： 3 0 0 0 r / min ,3 . 6 酶标仪。3 . 7 均质器或灭菌乳钵。3 . 8 架盘药物天平： 0 8 -5 0 0 g ， 精确至0 . 5 g o3 . 9 细菌浓度比浊管： Ma c F a r l a n d 3 号。3 . 1 0 灭菌广口瓶： 5 0 0 mL o3 . 1 1 灭菌锥形瓶： 5 0 0 mL , 2 5 0 ml , ,3 . 1 2 灭菌吸管 ： 1 ml - （ 具 0 . 0 1 m l 一 刻度） , 5 MI , （ 具 0 . 1 m l , 刻度） 。3 . 1 3 灭菌培养皿 ： 直径 9 0 mm.3 . 1 4 灭菌试管 ： 1 0 m mX7 5 m m, 1 6 m mX1 6 0 m m,3 . 1 5 注射器： 0 . 2 5 mL ， 连接内径为1 m m塑料小管一段。3 . 1 6 灭菌的刀子、 剪子、 镊子等。3 . 1 7 小 白鼠: l日4日龄。3 . 1 8 硝酸纤维素滤膜1 5 0 m m X5 0 mm, 向. 4 5 t m。临用时切成两张， 每张7 5 mmX 5 0 m m， 用铅笔划格 ， 每格 6 mm X 6 m m， 每行 1 0 格， 分 6 行。灭菌备用 。免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t )免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 4 7 8 9 . 6 -2 0 0 34 培养基和试剂4 . 1 乳糖胆盐发酵管： 按 G B / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3中 4 . 9 规定 。4 . 2 营养肉汤 ： 按 G B / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3 中 4 . 8 规定。4 . 3 肠道菌增菌肉汤： 按 G B / T 4 7 8 9 . 2 8 - - 2 0 0 3中 4 . 1 8 规定。4 . 4 麦康凯琼脂 ： 按 G B / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3中4 . 2 4 规定 。4 . 5 伊红美蓝琼脂（ E MB ) ： 按 G B / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3 中 4 . 2 5 规定。4 . 6 三糖铁琼脂（ T S I ) ： 按 G B / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3 中 4 . 2 6 , 4 . 2 7 规定。4 . 7 克氏双糖铁琼脂（ K I ) ： 按 G B / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3 中 4 . 2 8 , 4 . 2 9 规定 。4 . 8 糖发酵管（ 乳糖、 鼠李糖、 木糖和甘露醇） ： 按G B / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3 中3 . 2 规定。4 . 9 赖氨酸脱梭酶试验培养基 ： 按 G B / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3中 3 . 1 2 规定。4 . 1 0 尿素琼脂（ p H7 . 2 ) ： 按 G B / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3 中 3 . 1 5 规定。4 . 1 1 氛化钾（ K C N ） 培养基： 按 G B / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3 中 3 . 1 6 规定。4 . 1 2 蛋白陈水 、 靛基质试剂 ： 按 G B / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3 中 3 . 1 3 规定。4 . 1 3 半固体琼脂： 按 G B / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3中 4 . 3 0 规定。4 . 1 4 H o n d a 氏产毒肉汤： 按 G B / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3中 4 . 3 4 规定 。4 . 1 5 E l e k氏培养基： 按 G B / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3 中 4 . 3 5 规定。4 . 1 6 氧化酶试剂： 按 G B / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3 中 3 . 1 8 规定。4 . 1 7 革兰氏染色液： 按 G B / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3 中 2 . 2 规定。4 . 1 8 致病性大肠埃希氏菌诊断血清、 侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清、 产肠毒素大肠埃希氏菌诊断血清、 出血性大肠埃希氏菌诊断血清。4 . 1 9 产肠毒素大肠埃希氏菌 L T和 S T酶标诊断试剂盒。4 . 2 0 产肠毒素L T和S T大肠埃希氏菌标准菌株。4 . 2 1 抗L T抗毒素。4 . 2 2 多粘菌素B 纸片： 3 0 0 1 U, 0 1 6 m m.4 . 2 3 0 . 1 硫柳汞溶液。4 . 2 4 2 伊文思蓝溶液。5 检 验程序致泻大肠埃希氏菌检验程序见图免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t )免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 4 7 8 9 . 6 - 2 0 0 3检样测大肠菌群MP ti2 5 9 营养肉 汤3 6 C 1 I C 2 2 5 mL污染严重的检样匀液6 h乳糖发酵阳性 的发醉管肠道菌增 菌肉汤麦康凯EM B3 6 C士I L！ 1 8h 2 4 h乳糖发酵或不发酵的菌落 3 个一 5 个， 氧化酶一， 革兰氏阴性杆菌丁 St, 靛荃质、p H 7 . 2 尿素、 K C ,赖氨酸、动力T S I 底层 一 ，H 2 S - ,K C ti - ，尿素 非如左述的各种反应结果血清 学试验E T EC- E P E C一或EHE C- ( 0 1 5 7)E 丁E C-非 如左 述的各种结 果肠毒素 一 腆氨酸 一 ，靛荃质 4动力 一（ 01 2 4 动力一介）肠道致病性人肠埃希氏菌 或肠道出血性大肠埃希氏菌产肠毒素大肠 埃希 氏菌肠道侵袭性人肠埃希氏菌饭 公 图 1免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t )免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 4 7 8 9 . 6 -2 0 0 3操作步骤6 . 1 增菌 样品采集后应尽快检验。除了易腐食品在检验之前预冷藏外， 一般不冷藏。以尤菌操作取检样2 5 g ( m L ) ， 加在2 2 5 m l . 营养肉汤中， 以均质器打碎1 m i n 或用乳钵加灭菌砂磨碎。取出适量， 接种乳糖胆盐培养基， 以测定大肠菌群MP N， 其余的移人 5 0 0 m l - 广口瓶内， 于3 6 士1 培养 6h 。挑取1 环， 接种于 1 管 3 0 m l ， 肠道菌增菌肉汤内， 于 4 2 培养 1 8 h .6 . 2 分离 将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板； 污染严重的检样， 可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板， 于3 6 士1 培养1 8 h -2 4 h ， 观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落， 同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发酵的菌落。6 . 3 生化试验6 . 3 . 1 自 鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂 （ T S I ） 或克氏双糖铁琼脂（ K I ) 。同时将这些培养物分别接种蛋白陈水、 半固体、 p H 7 . 2 尿素琼脂、 K C N 肉汤和赖氨酸脱梭酶试验培养基。以上培养物均在 3 6 培养过夜。6 . 3 . 2 T S I 斜面产酸或不产酸， 底层产酸， H Z S阴性， K C N阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希氏菌。T S I 底层不产酸， 或 H 2 S , K C N , 尿素有任一项为阳性的培养物， 均非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。6 . 4 血清学试验6 . 4 . 1 假定试验： 挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌琼脂培养物， 用致病性大肠埃希氏菌、 侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒素大肠埃希氏菌多价0血清和出血性大肠埃希氏菌0 1 5 7 血清做玻片凝集试验。当与 某一种多价 O血清凝集时， 再与该多价血清所包含的单价 0血清做试验。致泻大肠埃希氏菌所包括的 0抗原群见表 1 。如与某一个单价 O血清呈现强凝集反应， 即为假定试验阳性。 表 1 致泻大肠埃希氏菌所包括的 O抗原群大肠埃希氏菌的种类 所包括的O抗原群 EPE（ 二 02 6 05 5 086 011 1 ab 01 1 4 01 1 9 01 2 5a c 01 27 01 2 8 a b 1 ) 1 4 2 01 5 8 EH EC （ ） 5 7 EI EC 02 8 a c 029 011 2 a c 01 1 5 01 2 4 01 3 5 01 36 01 4 3 0 1 4 4 01 5 2 016 4 01 6 7 ETEC 06 Ol l 01 5 02 0 02 5 02 7 06 3 07 8 08 5 01 1 4 01 1 5 01 2 6 01 2 8 a c 01 4 8 01 4 9 01 5 9 01 6 6 01 6 7 6 . 4 . 2 证实 试验： 制备 O抗原悬 液， 稀释至与 Ma c F a r l a n d 3号 比浊管相当的浓度。原效价为( 1 0 1 6 0 ） 一（ 1 : 3 2 0 ） 的 ） 血清， 用 。 . 5 %盐水稀释至 1 : 4 0 ,稀释血清与抗原悬液在 1 0 m m X 7 5 m m试管内等量混合， 做单管凝集试验。混匀后放于5 0 水浴锅内， 经1 6 h 后观察结果。如出现凝集， 可证实为该 O抗原。6 . 5 肠毒素试验6 . 5 . 1 酶联免疫吸附试验检测 L T和 S T6 . 5 . 1 . 1 产毒培养： 将试验菌株和阳性及阴性对照菌株分别接种于 0 . 6 m L C A Y E培养基内， 3 7 0C 振荡培养过夜。加人 2 0 0 0 0 1 U / m l . 的多粘菌素 l 3 0 . 0 5 m l ， 于 3 7 0C 1 h . 离心 4 0 0 0： m i n 1 5 m i n ， 分离土清液， 加人 。 。 1 硫柳汞 0 . 0 5 m l , ， 于 4 保存待用。6 . 5 . 1 . 2 1 . T检测方法（ 双抗体夹心法） ： a ) 包被： 先在产肠毒素大肠埃希氏菌 Ul 和 S T酶标诊断试剂盒中取出包被用 L T抗体管， 加人免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t )免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 4 7 8 9 . 6 -2 0 0 3 包被液0 . 5 mL ， 混匀后全部吸出于3 . 6 m L包被液中混匀， 以每孔1 0 0 j .L量加人到4 0 孔聚苯 乙烯硬反应板中， 第一孔留空作对照， 于 4 冰箱湿盒中过夜。 b ) 洗板： 将板中溶液甩去， 用洗涤液 I 洗三次， 甩尽液体， 翻转反应板 ， 在吸水纸上拍打， 去尽孔中 残留液体 。 c ） 封闭： 每孔加 1 0 0 I c L封闭液， 于3 7 0C 水浴中i h , d ) 洗板： 用洗涤液n 洗三次， 操作同上。 e ） 加样本 ： 每孔分别加各种试验菌株产毒培养液 1 0 0 l L , 3 7 水浴中 1 h o f ) 洗板： 用洗涤液 n 洗三次， 操作 同上。 8 ） 加酶标抗体 ： 先在酶标 L T抗体管中加 0 . 5 mL稀释液 ， 混匀后全部吸出于 3 . 6 m L稀释液中 混匀， 每孔加 1 0 0 IA L , 3 7 水浴中1 h o h ) 洗板 ： 用洗涤液 n 洗三次， 操作 同上。 i ) 酶底物反应： 每孔（ 包括第一孔） 各加基质液1 0 0 p L ， 室温下避光作用5 m i n -1 0 m i n ， 加人终止 液5 0 tA L . i ） 结果判定 ： 以酶标仪在波长4 9 2 n m 下测定吸光度 O D值， 待测标本 O D值大于阴性对照 3 倍以 上为阳性， 目 测颜色为桔黄色或明显高于阴性对照为阳性 。6 . 5 . 1 . 3 S T检测方法（ 抗原竟争法） ： a ) 包被 ： 先在包被用 S T抗原管中加 0 . 5 m L包被液， 混匀后全部吸出于 1 . 6 m L包被液 中混匀 ， 以每孔5 0 f L加人于4 0 孔聚苯乙烯软反应板中。加液后轻轻敲板， 使液体布满孔底。第一孔 留空作对照， 置 4 冰箱湿盒中过夜。 b ) 洗板： 用洗涤液I 洗三次， 操作同上。 c ） 封闭： 每孔加1 0 0 j .L封闭液， 3 7 水浴1 h o d ) 洗板 ： 用洗涤液 n 洗三次， 操作同上。 e ） 加样本及S T单克隆抗体： 每孔分别加各试验菌株产毒培养液5 0 Ii L ， 稀释的S T单克隆抗体 5 0川J （ 先在S T单克隆抗体管中加0 . 5 m L稀释液， 混匀后全部吸出于1 . 6 m L稀释液中， 混匀 备用） , 3 7 水浴 1 h o f ) 洗板： 用洗涤液 n洗三次， 操作同上。 g ） 加酶标记兔抗 鼠I g 复合物 ： 先在酶标记兔抗 鼠I g 复合物管中加0 . 5 mL 稀释液， 混匀后全部吸 出于 3 . 6 ml . 稀释液中混匀， 每孔加 1 0 0 l L , 3 7 0C 水浴 1 h o h ) 洗板： 用洗涤液 n 洗三次， 操作同上。 i ) 酶底物反应 ： 每孔（ 包括第一孔） 各加基质液 1 0 0 川洲 ， 室温下避光 5 min -1 0 m i n ， 再加人终止液 5 0 f L o l ) 结果判定： 以酶标仪在波长4 9 2 n m下测定吸光度（ O D ） 值， 计算见式（ 1 ) ;吸光度 阴性对照 O I ） 值 一待测样本 O D值阴性对照O D 值X 1 0 0 （1） 吸光度大于等于 5 0 为阳性 。目 测无色或明显淡于阴性对照为阳性。6 . 5 . 2 双向琼脂扩散