治疗性抗体研发的进展和关键技术ppt课件.ppt

1,治疗性抗体研发的进展和关键技术,2,主要内容,治疗性抗体研发概况 治疗性抗体研发的主要进展 治疗性抗体研发中要注意的问题,3,4,5,用抗体药物治疗的疾病,肿瘤 自身免疫病 感染性疾病 抗移植排斥 心血管疾病,骨质疏松 罕见病 眼黄斑变性 炭疽,6,抗体结构与功能关系,7,8,抗体药物在临床应用中面临的挑战,免疫原性 杀伤靶细胞的活性弱 成药性问题 新靶点,抗体药物研发的主要进展,降低抗体的免疫原性 改变抗体的效应功能 提高抗体表达量 引入先进的抗体表征和质控方法 改进抗体规模化生产技术 新靶点的发现,10,11,人源抗体制备的主要技术,EB病毒转化人B细胞 人-人杂交瘤技术 抗体库技术 转基因小鼠 人工设计和合成人源抗体,12,抗体库技术,转基因小鼠,13,人工设计和合成人源抗体,HF人源抗体对Her2+ +细胞的ADCC杀伤效应分析,1986 1994 1997 1998 2000 2001 2002 2003 2004 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012,15,第二代抗体药物,抗TNF adalimuab (Humira，全人抗体） certolizumab（Cimzia，PEG修饰的Fab） golimumab （Simponi，全人抗体） 抗CD20 ofatumumab （Arzerra， 全人抗体） 抗RSV motarizumab （亲和力更高） 抗EGFR panitumumab （Vectibix， 全人抗体）,16,抗体效应功能的改造,定点突变改造Fc 改变糖基化 双特异性或多特异性抗体,17,减弱抗体的效应功能,Fc上进行定点突变 Teplizumab(Leu234Ala,Leu235Ala) 去糖基化 Otelixizumab(去糖基化，Asn297Ala) 选择IgG4亚型或杂合亚型（IgG2/IgG4） Fc融合蛋白,18,提高抗体的效应功能,双特异性抗体,19,20,1 抗体Fc突变提高效应功能,突变Ser239Asp，Glu330Leu，ILe332Glu提高ADCC 突变Gly236Ala，Ser239Asp，ILe332Glu提高ADCP和ADCC 杂合IgG亚型提高CDC 突变Met252Tyr，Ser254Thr，Thr256Glu增加抗体的半寿期,21,2 改变抗体Fc的糖基化,22,各种糖基化变化对抗体功能的影响,来自潘海报告,23,第三代抗体药物,抗CD20 obinutuzumab（糖基化改造，提高 ADCC） AME-133v (Fc改造，提高ADCC) TRLI-05 (Fc改造，提高ADCC) Pro13192 (Fc改造，提高ADCC) 抗RSV/F MEDI-557 (Fc改造，增加半寿期),24,3 抗体上偶联细胞毒物质,25,26,单抗: 癌细胞表面过量表达的抗原且能内吞。 偶联链: 在血液中稳定但可以在细胞内释放毒素。 毒素药物: 需要极毒的可以抑制细胞生长的化合物,27,FDA批准的ADC药物,放射性同位素，Bexxar, Zevalin 毒素 小分子药物，Mylotarg，T-DM1 Adcetris,28,4 双特异性抗体,29,欧洲上市的双特异性抗体,30,在临床试验的双特异性抗体,31,5 免疫细胞因子,32,靶抗原选择,针对已确认过的靶 临床确认 实验确认 寻找新的功能性靶抗原,33,自身免疫病的治疗靶,34,上市抗肿瘤抗体药物的靶抗原,35,36,37,发现药物靶标的主要方法,分子流行病学调查 人类遗传学研究 人类功能基因组学 蛋白组学 生物信息学 药理学 模式动物,38,39,治疗性抗体研发中要注意的问题,抗体分子结构特点：四条肽链，重链糖基化，结构上有较多二硫键,40,Protein expression Solubility stability,抗体结构与成药性的关系,41,单抗体生产工艺和过程,李锋,42,从细胞表达到病人临床注射，单抗体药物可能发生多种反应变化,细胞培养,配伍制剂 和储藏,分离纯化,临床注射和 新陈代谢,酶糖基化 化学糖基化 还原反应 序列变异 ,还原反应 水解反应 聚合化,氧化反应 异构化 化学糖基化 ,脱氨基化 巯基半胱胺酸化 酶降解反应 ,理化分析和质量控制对于抗体制药工业各个环节起着支持和指导的重要作用。 如同眼睛对人的作用一样，没有好的分析手段和方法，抗体生产过程就可能走向歧途。,引自张伯彦报告,43,可变区： 选择Gln为氨基末端，减少电荷变异 突变CDR区上不稳定的点 突变某些氨基酸，避免抗体聚合 去除可变区上的糖基化位点 恒定区： 铰链区改造避免出现半个抗体和不规则 二硫键或异型结构 提高与FcRn结合，增加血清半寿期,影响抗体药物稳定性和效能的因素,单抗体药物产品是各种变异体的混合物,电荷变异体 by iCIEF,序列变异体 by Tryptic Peptide Map Clone# M83R,体积变异体 by SEC 二聚体,脱氨基化 (32) Met 氧化 (22) 糖基化（22) 高甘露糖化,G0, G1,G1,G2（5） 唾液酸化（5） C-端Lys （2） 2644552=9600 (9600)2 108 约1亿个可能的变异体！,美国FDA： Steven Kozlowski 基因特克： Wassim Nashabeh,45,1。影响抗体质量的蛋白表达后修饰细胞内细胞外都有发生； 2。质控的目标是降低或避免在生产过程中不希望看到的 PTM和序列变异发生的现象。,克隆筛选是质量控制的关键步骤,mAb Variants and Characterization Methodologies,Size Variants (体积变异体） Terminologies: Aggregates, main peak, fragments Assays: HPSEC, CE-SDS, SDS-PAGE, AUC Charge Variants （电荷变异体） Terminologies: Acidic peak, main peak, and basic peak variants Assays: HPIEC, iCIEF, pH-IEC Sequence Variants （序列变异体）: caused by unintended amino acid substitutions Terminologies: sequence polymorphism; mutation; mis-incorporation; sequence extension, insertion, deletion, and crossover. Assays: Multiple proteolysis peptide mapping methods with LC-UV-MS/MS data analysis Structural Variants （高级结构变异体） Terminologies: high order structure (HOS); tertiary structural isomer. Assays: HDX-MS, hydroxyl radical oxidation foot-printing, other emerging techniques.,46,47,Yang, Y., et al, mAbs, 2010, 2 :3, 285-298.,Comparison of peptide map UV profiles from the top four clone-derived mAb samples quickly detected two sequence variants (N1: M83R at 5% and N2: P274T at 42% protein levels) from two clones among the four.,UV肽图对比方式可以