免疫学检验5凝集反应.ppt

如何鉴定ABO血型？,ABO血型的确认原则是什么？ 如何鉴定RBC上的血型抗原或血清中的血型抗体类型 ？ 采用凝集反应。,第五章 凝集反应 （agglutination）,一、定义 颗粒性抗原（或可溶性抗原与载体颗粒结合成致敏颗粒后）与相应抗体发生特异性反应，在适当电解质存在下，形成肉眼可见的凝集块。,第一节 凝集反应概述,二、发生机制 分两阶段进行。 特异性结合阶段 抗原与相应抗体发生特异性结合。 速度快，不可见。 可见反应阶段出现肉眼可见特异性凝集。 抗原抗体复合物进一步交联聚集所致。 受到多种因素的影响。,二、发生机制 分两阶段进行。 特异性结合阶段 抗原与相应抗体发生特异性结合。 速度快，不可见。 可见反应阶段出现肉眼可见特异性凝集。 抗原抗体复合物进一步交联聚集所致。 受到多种因素的影响。,抗原颗粒,抗体,NaCl,可见反应,抗原抗体复合物,图注：,特异性结合,抗原抗体相对应,抗原颗粒,抗体,NaCl,可见反应,抗原抗体复合物,图注：,特异性结合,抗原抗体相对应,三、影响因素 抗原因素： 颗粒性抗原 抗原表位数目等 抗体因素： 来源（多克隆抗体）、亲和力、效价（含量）等。 IgM的凝集作用IgG。 不完全抗体：与相应抗原结合，但不形成可见的凝集现象。主要为小分子的IgG类抗体。,IgM抗体凝集细胞示意图,IgG抗体凝集细胞示意图,IgM,细胞,IgG,细胞,不完全抗体与相应颗粒抗原结合,RBC,7S的IgG,不凝集,+,三、影响因素,环境因素： 电解质（生理盐水） 酸碱度：避免酸凝集。 温度：37。 抗原与抗体的适当比例 易出现抗体过量前带抑制。,四、凝集反应的应用 抗原（ Ag）或抗体（ Ab ）的定性检测 未知Ag（或Ab）已知Ab（或Ag）是否出现凝集 若出现凝集，则表明有相应Ag（或Ab）存在； 若不出现凝集，则表明无相应Ag（或Ab）存在。 抗体的半定量检测 将待检标本（未知Ab）作一系列倍比稀释后加入定量抗原（已知Ag）进行反应，以出现凝集反应的最高稀释度作为Ab的效价或滴度。,应用凝集反应进行检测，在判定结果时需考虑： 影响因素存在时会干扰凝集的出现：若抗原与抗体相对应，但因受多种因素影响而不出现特异性凝集可导致假阴性结果。 非特异性凝集可干扰结果的判断：若抗原与抗体并不对应，但存在非特异性凝集可导致假阳性结果。,应用凝集反应进行检测，在判定结果时需考虑： 影响因素存在时会干扰凝集的出现：若抗原与抗体相对应，但因受多种因素影响而不出现特异性凝集可导致假阴性结果。 非特异性凝集可干扰结果的判断：若抗原与抗体并不对应，但存在非特异性凝集可导致假阳性结果。,凝集反应和沉淀反应的不同点,五、凝集反应的类型,直接凝集反应。 间接凝集反应。 其他凝集技术。,第二节 直接凝集反应 （direct agglutination test） 定义： 颗粒性抗原 + 相应抗体 肉眼可见凝集块 （细菌，RBC等） 参与反应的抗原称为：凝集原（agglutinogen） ； 抗体称为：凝集素（agglutinin） 。,NS,NS,第二节 直接凝集反应 （direct agglutination test）,常用方法： 玻片法 试管法 微量血凝反应板法,一、玻片凝集试验 （slideagglutination test）,定性试验，常用已知Ab测定未知Ag(待检样本)。 结果判读： 已知Ab 未知Ag 凝集，阳性(+)。 不凝集，阴性(-)。 方法评价：特异性强， 简便、快速；敏感度稍低。 应用： ABO血型鉴定； 细菌的鉴别与分型。,抗 A,抗 B,1. 已知标准血清（已知抗体）,2.受检者5%RBC悬液 （未知抗原）,3.结果判断：,不凝集,4.根据有无凝集现象来判断血型,凝集,ABO血型的鉴定,ABO血型鉴定结果示意图,抗A标准血清,抗B标准血清,抗A标准血清,抗B标准血清,抗A标准血清,抗B标准血清,抗A标准血清,抗B标准血清,血型判断：B型,血型判断：O型,血型判断：AB型,血型判断：A型,某检验人员在实际工作中，出现了ABO血型的定型错误。请你分析造成此错误的可能原因有哪些？ 技术问题： 责任心不强，未按要求操作； ABO标准血清质量不高：效价太低、亲和力不强，误判为阴性反应； 红细胞浓度过淡或过浓：导致抗原抗体比例不适当，误判为阴性反应； 各种原因引起的红细胞溶解（溶血），误判为阴性反应； 操作器材不洁，红细胞被细菌污染，红细胞自凝（冷凝集）、假凝集及细菌性凝集等干扰了结果的判断，可出现假阳性。 如何避免？ 爱岗敬业，规范操作，试剂避免细菌污染。 所用器材必须干燥清洁、防止溶血。 设置对照：阳性对照、阴性对照、自身对照等。,某检验人员在实际工作中，出现了ABO血型的定型错误。请你分析造成此错误的可能原因有哪些？ 被检RBC问题： 受检者红细胞上抗原位点过少，如亚型；或白血病、恶性肿瘤等导致抗原减弱，弱凝集，误判为阴性反应。 由于细菌感染使红细胞出现获得性类B抗原，易误判为阳性。 如何避免？ 用已知血型的标准红细胞检查待检血清中未知的抗体。 通常采用试管法。,细菌的鉴别,用已知细菌诊断血清检测待检细菌 方法： 轻摇玻片，12分钟后观察 结果判定：右侧为阴性对照，不凝集时结果有效 若左侧出现凝集块为阳性，反之为阴性 根据左侧是否出现凝集来判断待检菌的种类,NS待检菌诊断血清,NS待检菌,二、试管凝集试验 (tube agglutination test),试管法：半定量试验。 常用已知Ag，测定未知 Ab(待检血清)。 方法评价： 特异性易受影响； 敏感性不高。 应用： 多用以测定抗体的含量（效价、滴度）。 肥达氏反应、外斐氏反应、交叉配血试验。,0.5,0.5,0.5,0.5,0.5,弃掉0.5,试管凝集试验原理,结果,1 2 3 4 5 6 7,菌液,结果观察：观察管底是否有凝集现象。 完全凝集（）：凝集块完全沉于管底，液体澄清。 75%凝集（）：凝集块沉于管底，液体稍混。 50%凝集（）：凝集块沉于管底，液体混浊。 以上结果均为阳性，均出现肉眼明显可见的凝集。 25%凝集（弱阳性）：液体混浊。 阴性：无变化。 结果判读： 以产生明显凝集现象（“”）的最高稀释度作为Ab的效价（含量）。,第三节 间接凝集反应 (indirect agglutination test),一、载体种类 二、间接凝集反应类型 三、间接血凝试验 四、胶乳凝集试验 五、间接凝集试验的应用,间接凝集试验：用人工方法将可溶性抗原(或 抗体）吸附或偶联于载体上，使之成为致敏 载体颗粒，再与相应抗体（或抗原）作用， 在适宜电解质的参与下，出现的凝集现象。,优点：敏感度比直接凝集反应高 28倍，亦明显高于沉淀反应。,间接凝集反应（indirect agglutination test） 可溶性抗原+载体颗粒致敏颗粒+相应抗体凝集块 （RBC、胶乳颗粒等）,载体,可溶性抗原,致敏,NS,致敏颗粒,凝集,载体(carrier):试验体系中与免疫无关的颗粒。,对载体的要求： 不溶于水，在NS中性质稳定，无化学、血清学活性。 大小均一，短时间内不致下沉。 能够直接吸附或偶联抗原或抗体，且不影响其活性。,致敏：抗原(或抗体)偶联于颗粒表面的过程。,致敏颗粒（sensitized particle):吸附有已知抗 原或抗体的颗粒。,载体,可溶性抗原,致敏,致敏颗粒,NS,凝集颗粒,间接凝集试验示意图,间接凝集试验示意图,一、常用载体种类,红细胞： 新鲜红细胞吸附蛋白质的能力差。一般先醛化后应用。 聚苯乙烯胶乳颗粒： 可物理吸附蛋白质；常制备带有化学活性基团的颗粒。 活性炭： SPA：,二、间接凝集反应类型,根据致敏用的试剂和反应方式分为：,2.反向间接凝集试验（reverse indirect agglutination test）,3.间接凝集抑制试验（indirect agglutination inhibition test）,1.(正向)间接凝集试验（indirect agglutination test）,4.协同凝集试验 （coagglutination test）,载体,可溶性抗原,致敏,致敏颗粒,NS,凝集颗粒,1.（正向）间接凝集试验,用特异性抗原致敏载体，检测标本中的相应抗体的方法。,待测抗体,结果判读：凝集，阳性(+)。 不凝集，阴性(-)。,2. 反向间接凝集试验,用特异性抗体致敏载体，检测标本中的相应抗原的方法。,载体,已知抗体,致敏,致敏颗粒,NS,凝集颗粒,待测抗原,结果判读： 凝集，阳性(+)。 不凝集，阴性(-)。,3.间接凝集抑制试验,待测抗原,已知抗体,特异结合,抗原抗体复合物,NS,致敏颗粒,用抗原致敏载体及相应抗体作为诊断试剂，用于检测标本中是否存在与致敏载体相同的抗原。,无凝集颗粒为阳性,间接凝集抑制试验,待测抗原,已知抗体,无结合,抗原抗体分散,NS,致敏颗粒,有凝集颗粒为阴性,原理,4.协同凝集试验,SPA能与血清中的IgG类抗体的Fc段非特异性结合，而两个Fab段暴露在葡萄球菌菌体表面，仍然保持正常的抗体活性，与特异性抗原相遇时，能出现特异的凝集现象。,应用,微生物的快速诊断、定种及定型；以协助传染病的早期诊断。,原理图,IgG,SPA,SPA- IgG,待测抗原,SPA- IgG-待测抗原凝集颗粒,混合,加入,原理,三、间接血凝试验(被动血凝试验),将可溶性抗原(或抗体）吸附人的“O”型血红细胞或绵羊或家兔的红细胞，制成致敏血红细胞,与相应抗体（或抗原）作用，在适宜电解质参与下，出现红细胞凝集现象。,RBC为载体： 动物，或人的“0”型血RBC 醛化红细胞： 用戊二醛处理，成团，不易摇散；吸附大，耐温，耐冻融。 致敏红细胞保存时间短，易变脆、溶血、被污染，因此在致敏前醛化。 致敏醛化红细胞：用Ag/Ab直接或化学联结，与RBC作用，吸附于RBC的过程。,（indirect hemagglutination test),红细胞,抗原,致敏,致敏红细胞,NS,红细胞凝集,间接血凝试验,间接血凝试验原理,待测抗体,结果示意图,-,+,+,+,+,+,结果判断: 效价？,方法评价： 敏感性较强、简便、快速、成本低廉,原理,四、胶乳凝集试验,将可溶性抗原(或抗体）与胶乳结合后，直接与待测标本中相应抗体（或抗原）发生凝集反应。,方法评价： 1.胶乳颗粒的性能比 RBC稳定、均一性好 2.与抗原结合的能力 及凝集性能不如RBC,（indirect hemagglutination test),应用: 类风湿因子检测等,1. 抗体的检测 检测细菌、病毒寄生虫感染后产生的抗体 自身免疫病患者的抗体的检测 变态反应患者的抗体的检测 2. 抗原的检测,五、间接凝集试验的应用,检测甲胎蛋白（AFP）、HCG等抗原,第四节 其它凝集技术,一、抗球蛋白试验 (antiglobulin test) 二、自身红细胞凝集试验 (autologous red cell agglutination test) 三、冷凝集试验 (cold agglutination test),原理,一、抗球蛋白试验(Coombs试验),机体受某些抗原刺激后产生“不完全抗体”，其与相应抗原结合后不出现可见的凝集现象，但能封闭抗原决定簇，使其不能再与完全抗体结合。,类型,(antiglobulin test),1.直接法 2.间接法,方法：将人球蛋白，注入异种动物，获得抗球蛋白。此种抗体加入表面结合有不完全抗体的红细胞的复合物中，就能出现可见的凝集现象。,是检测抗红细胞不完全抗体的一种非常经典的方法。 RBC不完全抗体(IgG) RBC不凝集。 RBC不完全抗体(一抗) 抗球蛋白抗体(二抗) RBC凝集。 常用方法： 直接Coombs试验：检测RBC上的不完全抗体。 间接Coombs试验：检测游离在血清中的不完全抗体。,直接法,作用：检测红细胞表面结合的不完全抗体。 临床意义：新生儿溶血症和自身免疫性溶血性贫血的诊断。,RBC为Rh+,7S的IgG,体内发生,+,抗IgG,体外测试,抽血,间接法,作用：检测游离在血清中的不完全抗体。 临床意义：输血前的交叉配血、不相溶输血后的抗体检测。检测母体 Rh（D）抗体有助于及早发现及避免新生儿溶血症。,RBC为Rh+,不完全抗 体试剂,+,抗IgG,体外测试,二、自身红细胞凝集试验,原理类似于间接血凝试验。 区别点：RBC为受检者新鲜RBC。 所用抗体为双功能抗体(即能结合红细胞，也能结合待检抗原)。 反应特点： 1.受检标本为全血，不需分离血清。 2.采手指血或耳垂血，立刻检测出结果。 3.已成功应用于抗HIV抗体的检测。,概念,三、冷凝集试验,冷凝集素是红细胞某些抗原的自身抗体，只能在低温时与其相应的抗原结合。,(cold agglutination test),冷凝集反应在 4时最强烈，红细胞凝集最明显；温度升高后，抗原抗体复合物解离，凝块消失。,意义,原理,冷凝集素增高常见于：单核细胞增多症和支原体肺炎。恶性淋巴瘤呈现慢性增高。,冷凝集试验原理,抗原决定簇隐含，不能与抗体结合,混 合,暴露的抗原决定簇与抗体结合,混 合,37,4,37,练习题: 1.下列那种抗原不是颗粒性抗原（ ） A.金黄色葡萄球菌； B.伤寒杆菌； C.红细胞； D.抗原包被的乳胶微粒； E.细菌外毒素,2.肥达氏反应的原理是（ ） A.直接凝集； B.间接凝集； C.间接凝集抑制试验； D.沉淀反应； E.补体结合,3.交叉配血试验属于（ ） A.直接