双向电泳培训师培训讲义.doc

Bio-Rad 双向电泳培训讲义(2006年3月上海)内 容1. 培训前的准备工作-32. 培训目的及要求-33. 时间安排-34. 双向电泳常用仪器及试剂清单-45. 仪器清点(IEF,Mini Protean3, ProteanII) -56. 仪器开机检查-77. 概述 蛋白质组学双向电泳-88. 双向电泳实验流程-99. 2D Start Kit简介 -1010. 双向电泳演示实验操作步骤-11附1实验注意事项-17附2 聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配方-2111. IEF使用过程中的常见及解决方-2212. 双向电泳中实验中常见问题-2413. 双向电泳培训测试题- -40本讲义以2D Start Kit为主要操作流程，如对双向电泳实验原理及样品品备有兴趣，请参考“双向电泳实验指南”（蓝色印刷版），如自行配制试剂可参考“BIO-RAD双向电泳中文手册”一、 培训前的准备工作1 核对合同清单及装箱单2 检查是否有所需的全部试剂3 检查是否有所需的全部仪器（IEF主机，MiniP3，电源，GS800，PDQuest软件）4 电话确认培训时间、地点及人员，并就培训内容及相关仪器和试剂和老师进行确认。5 打印培训资料二、 培训目的及要求1 通过本次培训，掌握仪器的基本操作，并能对用户进行简单培训，保证用户能正常使用2D系统进行科研活动2 初步掌握对用户进行培训的基本知识，并能合理安排培训进程。3 学会对一些应用过程中简单问题的处理方法4 学习双向电泳的基础知识5 能对IEF进行正确编程，对正确组装Mini Protean III，灌胶、正确设置电泳参数。 三、 时间安排三天（以2人计算、两块7cm小胶）在客户处培训,可根据实际情况调整第一天下午2：00 3：30 实验原理及操作注意事项3：30 5：00 双向电泳第一向操作示范第二天上午9：0011：30 第二向准备工作及部分仪器演示第二天下午1：00 5：00 转移及第二向电泳，凝胶染色第三天上午9：0011：00 双向电泳软件培训,实验讨论四. 双向电泳常用仪器及试剂清单仪器清单（客户因购买情况不同可能不一样）CatDescription用户有的请打钩165-4000PROTEAN IEF System, complete165-3301Mini Protean 3165-3176PROTEAN II XL Multi-Cell, wide-format, 1.0 mm165-3188PROTEAN II XL Cell, wide-format, 1.0 mm165-4100Mini-Protean 3 Dodeca Cell165-4151PROTEAN Plus Dodeca Cell, 220/240 V165-4121Model 495 Gradient Former, 100-1,500 ml165-2005Exponential Piston, for Model 395/495 gradient former165-2008Tubing Connection Kit164-5070PowerPac Universal Power Supply, 100-120V/220-240V164-5050PowerPac Basic Power Supply, 100-120V/220-240V164-5052PowerPac HC Power Supply, 100-120V/220-240V试剂清单：CatDescriptionBio-Rad产品用户自行配制第一向等电聚焦相关试剂163-21052-D starter kit163-2001ReadyPrep IPG Strips, pH 4-7, 7cm, 12163-2129Mineral Oil, 500 ml第二向SDS PAGE电泳相关试剂161-015830% Acrylamide/Bis Solution,37.5:1, 500 ml161-0416SDS Solution, 10% (w/v), 250 ml161-0798Resolving Gel Buffer, 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8, 1 L161-0700Ammonium Persulfate, 10 g161-0800TEMED, 5 ml161-073210x Tris/Glycine/SDS, 1 L染料161-0786Bio-Safe Coomassie Stain用户需备有加样枪及Tip头、磁力搅拌器、pH计、微波炉、脱色水平摇床等如自行准备SDS PAGE试剂须备有甲叉（161-0201）、丙烯酰胺试剂（161-0101）、Tris（161-0719）、SDS（161-0301）、TEMED（161-0801）、过硫酸氨（161-0700）、甘氨酸（161-0718）（Bio-Rad产品或进口产品），考染染料（Coomassie Brilliant Blue R-250, 10 g（161-0400）或Coomassie Brilliant Blue G-250, 10 g（161-0406）和脱色液Mili Q纯水约2L左右五 仪器清点（Protean IEF, Mini Protean 3, Protean II XL）Protean IEF CellPROTEAN IEF等电聚焦电泳槽是PROTEAN IEF系统的核心部分， PROTEAN IEF电泳槽是IPG胶条电泳的专用设备。它具有以下特点： 高通量，可容纳24 根7 cm 胶条或12 根11 cm、17 cm、18cm 和24 cm 胶条。 大范围的工作温度（10-25） 内置10,000 V 高压, 2.4 mA 电流的电源完整的PROTEAN IEF（165-4000）包括以下组件，用户可以根据自已实验的需要选择相关组件1 主机PROTEAN IEF cell PROTEAN IEF电泳槽 （标配）2 聚焦盘应用于水化上样，适用于大部分蛋白，每个聚焦盘可对1-12胶条进行聚焦7cm focusing tray 7 cm聚焦盘（标配）11cm focusing tray 11cm聚焦盘（标配）17cm focusing tray17 cm聚焦盘（标配）3 水化/平衡盘7,11,17, rehydration/ equilibration trays 7,11,17,水化/平衡盘 25 个4 Forceps and cleaning brushes镊子和清洗刷5 Mineral oil矿物油6 Electrode wicks电极滤片选配18cm focusing tray18 cm聚焦盘24cm focusing tray24 cm聚焦盘Cup loading tray with movable electrodes带有可移动电极的杯上样聚焦盘Sample cups 样品杯凝胶盘规格 7 cm 11 cm17 cm18 cm 24 cm 聚焦盘电极间距离 6.5 cm 10.2 cm 16.2 cm17.1 cm 22.7 cm可容纳的胶条长度 8.2 cm 12.1 cm18.1cm20.1 cm25.3 cmReadyStripTM IPG胶条长度7.9 cm 11.8 cm 17.8 cm 19.0 cm 24.7 cm水化/平衡盘 可容纳的胶条长度 8.0 cm12.7cm 18.6 cm 20.4 cm 25.3 cm最大容积 3.5 ml 6.0 ml 7.5 ml 8.0 ml 12.0 mlMini-PROTEAN 3 电泳槽165-3301 Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell, 10-well, 0.75 mm thickness; complete system, includes 2 combs, 5 sets of glass plates, casting stand, casting clamp assembly, sample loading guide, electrophoresis module (electrode assembly, clamping frame, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam)大型PROTEAN II xi 和XL 电泳槽165-3188 PROTEAN II XL Cell, wide-format, 1.0 mm, includes PROTEAN II xi basic unit (165-1834) and 1.0 mm IPG conversion kit (165-3183)165-1834包括以下部分：1. 电泳槽及盖(Tank and lid)，各1个2. 中央制冷芯(Central cooling core)，共1个3. 托架（黑色） (Latch (black)，共1个4. 灌胶架(Casting stand)，共1个165-3183的IPG转化套件可将普通的PROTEAN II xi转化为可以做双向胶的PROTEAN II XL，包括以下部分： 宽的上槽密封垫 (2个) 20 cm 玻璃板 (2套，长、短玻璃板各2块) 20 cm 三明治夹(Sandwich clamps)，两对，共4个 灌胶架密封垫片（Replacement Gasket, Casting stand），共2个 胶板对位卡(Alignment card)，2个 窄边封边垫条 (4) 2D电泳梳 (2)六. 仪器开机检查1 IEF主机通电检查，如屏幕显示如下，则为正常 BIO-RAD LABORATORIESPROTEAN IEF CELLFIRMWARE VERSION 1.40SYSTEM INITIALIZATION 之后，屏幕会显示如下REHYDRATION PRESET METHOD STORED METHOD NEW METHOD 2 电源开机通电检查（以PowerPac Universal为例）之后，屏幕会显示如下3 检查其他仪器配件是否齐全，并填写安装报告。4 培训结束后，请老师签字。七. 概述蛋白质组双向电泳蛋白质组简介蛋白质组学（Proteomics）是以基因组所表达的全部蛋白质，即蛋白质组（Proteome）为研究对象的科学。活细胞的生命状态会受许多因素的影响而发生改变，胞内蛋白质在质或量上的变化是产生这种现象的重要机制，而目前不管是用在基因组水平、还是在转录组水平上得到的结果，都不足以对这种变化进行准确的描述。采用蛋白质组分析方法，不但可以确定在导致这种变化的过程中，究竟有哪些蛋白质在表达、其表达量如何、以及有没有翻译后修饰等特征，而且可以通过将同种生物的二种或多种不同状态的细胞 (正常与病态)样品进行比较，来识别出那些在质和量上发生特异性改变的蛋白质。蛋白质组分析的一个最大的问题，是如何实现复杂蛋白质样品处理时的高度重复性和稳定性，即样品处理过程不能改变其组分发生质和量的改变。双向电泳（2-D PAGE）技术可以在一块凝胶上分辨出1,800多个蛋白质点(Choe and Lee 2000)，能同时分析成百上千的基因表达产物，非常适于平行分析大量蛋白质的分离，因此成为目前蛋白质组研究中解决上述难题的首要方法(Cutler et al. 1999, Fegatella et al. 1999, Gorg et al. 2000)。将双向电泳后的凝胶图像结果，通过相应的图像扫描仪成像后，借助专门的软件对之进行分析，得到的各研究小组间的实验数据资料可以进行进一步的编录和比较。实验设计思路下图简示了蛋白质组学研究中的基本实验设计思路，并对该实验流程进行简要的说明。蛋白的发现生物信息学质谱蛋白消化蛋白切取成像和分析双向电泳生物样品样品制备生物学问题图1.2蛋白质组学实验设计思路八. 双向电泳实验流程样品制备样品制备是实验成败的关键，其具体的方法依据不同的研究目的来确定。样品制备的影响因素包括感兴趣蛋白质的溶解性、分子量、电荷数及等电点等。用于样品处理的缓冲液必须在低离子强度的基础上，既能保持蛋白质的天然电荷，又能维持其溶解性。(详见 “双向电泳实验指南”第二,第九章)第一向分离在第一向分离中蛋白质先按其等电点（isoelectric point pI值）分开。pI值就是使蛋白质不带净电荷，且在电场中不发生迁移的特定pH值。这项将蛋白质按其等电点分离的技术称为等电聚焦（IEF）。对双向电泳来说，等电聚焦最好是在一个固定pH梯度的凝胶（IPG）中运行。(详见 “双向电泳实验指南”第三,第十章)平衡胶条由第一向转移到第二向之前，需要先进行平衡。这一过程包括蛋白质二硫键的还原、半胱氨酸残基的烷基化，以及样品与SDS结合为第二向根据分子量(MW)的分离做准备等过程。(详见 “双向电泳实验指南”第四,第十章)第二向分离对第二向聚丙烯酰胺凝胶与单向的聚丙烯酰胺凝胶电泳一样,根据蛋白质分子量的范围来分离蛋白质。在蛋白质组研究中，需要在同样的条件下同时走多块胶，这对凝胶与凝胶之间的比较十分重要。(详见 “双向电泳实验指南”第四,第十章)染色凝胶染色的目的是使其中的蛋白质能够被观察到。目前还没有通用的染色方法，只能在考虑多种因素如需要的灵敏度、线性范围、方便程度、费用、以及成像设备的类型等基础上，结合自己的实际进行选择。有时也可以将蛋白转膜后通过免疫印迹的方法来进行检测。(详见 “双向电泳实验指南”第五,第十二章)成像成像设备可以摄入图像，对凝胶图像以数字形式保存，对每块凝胶图像进行平等的比较，在各研究组之间传递信息，并且对大量的数据进行归类分析。各种类 型的成像设备配有相应的分析软件，可以特异地收集、诠释、比较蛋白质组数据资料等。(详见 “双向电泳实验指南”第五,第十二章)软件分析 Bio-Rad的PDQuestTM软件，可以对凝胶的图像进行比较分析、蛋白质点注释、数据归类分析，还可以操纵Bio-Rad各种成像仪器以及蛋白切取工作站(ProteomeWorksTM )，并对蛋白组研究中产生大量的数据资料进行比较。(详见 “双向电泳实验指南”第七章)蛋白鉴定一旦通过差异分析或其它方法找到感兴趣的蛋白后，就可以从凝胶中切取这些蛋白质作鉴定。借助质谱分析，可以精确的测定蛋白质的分子量，并且通过数据库检索找到匹配的肽段。EQUest Spot Cutter全自动切胶系统可以将感兴趣的蛋白质点从凝胶上自动精确的切割下来，并将这些切割下来的蛋白点对应的转移到96孔微孔板中。这个蛋白切取工作完全可以用PDQuest软件控制所有的操作。对切割下来的蛋白质，可以送到质谱分析中心，中心会对这些蛋白点进行脱色、蛋白降解，然后进行生物质谱分析。可以用MALDI质谱仪进行肽质量指纹谱的自动分析。对于MALDI无法鉴定的蛋白质，可以用Q-Tof电喷雾 LC-MS-MS 工作站进行序列标签鉴定或进行蛋白质测序。九. 2D Start Kit简介本实验培训使用ReadyPrep 2-D Starter Kit(双向电泳启动试剂盒)，是为初次进行双向电泳操作设计,试剂包含一整套经测试的预混试剂,通过实验用户可掌握双向电泳实验技术要点,以便进一步开展研究工作。试剂盒中含以下内容: E. coli 蛋白样品， 2.7 mg ReadyPrep 双向电泳启动试剂盒再水化/样品缓冲液， 10 ml 1该标准配方适合许多蛋白样品；经性能测试的缓冲液能方便地用于制备样品。8 M urea, 2% CHAPS, 50 mMDTT, 0.2% (w/v) Bio-Lyte 3/10 ampholytes, Bromophenol Blue ReadyPrep 平衡缓冲液I，20 ml 220 ml of 6 M urea, 2% SDS, 0.375 M Tris-HCl (pH 8.8), 20% glycerol, and 2% (w/v) DTT ReadyPrep 平衡缓冲液II，20 ml 220 ml of 6 M urea, 2% SDS, 0.375 M Tris-HCl (pH 8.8), and20% glycerol.(使用时需加碘乙酰胺使之终浓度为2.5%) 30% 甘油溶液，70 ml 1 ReadyPrep 覆盖琼脂糖溶液，50 ml 1 碘乙酰胺,0.5 g 2 超纯水，15 ml 1不同胶条长度实验时间，本实验是7cm十. 双向电泳演示实验操作步骤(一) 样品制备及及等电聚焦1. 从冰箱中取出4保存的双向电泳启动试剂盒。2. 在上样缓冲液干粉瓶中加入6.1ml去离子水，使之溶解后，吸取2ml溶解后缓冲液，加入到E.coli蛋白样品瓶中，制成浓度为1.35mg/ml的蛋白质样品。双向电泳上样3. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。附:IPG胶条蛋白质载样量（考马氏亮蓝R-250）胶条长度加样体积样品蛋白量7 cm125 ul169 ug11 cm185 ul250 ug17 cm300 ul405 ug4. 取出-20冷冻保存的IPG预制胶条（7cm pH 4-7），室温中放置10分钟。而后，用镊子去除IPG胶条上的保护层。5将IPG胶条胶面朝下置于样品溶液上，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极并与电极紧密接触，不使胶条下面的溶液产生气泡。6. 在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油(根据不同胶条长度,本实验1.5ml)，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。7. 对好正、负极，盖上盖子。将聚焦槽水平放入等电聚焦仪中，设置等电聚焦程序。 7cm胶条水化12小时（18）主动水化（50V）或被动水化S1250V线性30分钟除盐S2500V快速30分钟除盐S34000V线性3小时升压S44000V快速20,000伏小时聚焦S5500V快速任意时间保持选择所放置的胶条数。设置每根胶条的极限电流。（50mA/根）设置等电聚焦时的温度。（20）11cm胶条水化12小时（20）主动水化（50V）或被动水化S1250V线性30分钟除盐S21000V快速30分钟除盐S38000V线性4小时升压S48000V快速40,000伏小时聚焦S5500V快速任意时间保持选择所放置的胶条数。 设置每根胶条的极限电流。（50mA/根）设置等电聚焦时的温度。（17）17cm胶条水化12小时（20）主动水化（50V）或被动水化S1250V线性30分钟除盐S21000V快速1小时除盐S310000V线性5小时升压S410000V快速60,000伏小时聚焦S5500V快速任意时间保持选择所放置的胶条数。设置每根胶条的极限电流。（50mA/根）设置等电聚焦时的温度。（20）8.聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条置于样品水化盘中，-20冰箱保存。聚焦结束后的胶条如果直接染色见下图。请注意正极位置有+，当所印字为正常时，该面为支撑膜面，面下为胶面。（二）第二向SDS-PAGE电泳Mini Protean III组装灌胶1. 配制12%的丙烯酰胺凝胶两块。配12ml凝胶溶液，每块凝胶6ml，将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留约1cm的空间，用MilliQ水或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。聚合45分钟。(7cm胶条)4%7.5%12%X%30% Acrylamide/Bis0.5 M Tris-HCl,3.3 ml25 ml40 ml(4.8 ml*)3.3(X%) = (A)* mlpH 6.81.5 M Tris-HCl,6.3 mlpH 8.825 ml25 ml(3 ml)25 ml10% SDSDistilled deionized250 l1.0 ml1.0 ml(0.12 ml)1.0 mlwater15 ml48.5 ml33.5 ml(4.02ml)73.5 - (A)*TEMED25 l50 l50 l(6 ul)50 l10% APS125 l500 l500 l(60 ul)500 lTotal volume25 ml100 ml100 ml(12 ml)100 ml*字母A 是指配制特定胶浓度(X%)所需的30% Acrylamide/Bis 溶液的体积 * 本次实验中请按12%胶一栏中括号里的黑体部分的数字进行配制。本表所采用的试剂如下：161-015730% Acrylamide/Bis Solution, 29:1, 2500ml预混合制胶液161-0700Ammonium Persulfate, 10 g161-0801TEMED, 50 ml161-0700Ammonium Persulfate, 10 g161-0798Resolving gel buffer, 1.5 M Tris-HCl pH 8.8, 1 L161-0416SDS Solution, 10 % (w/v ), 250 ml如未采用Bio-Rad的预混合制胶液而自行配制，请参阅第21页附录的聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配方2. 待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。 平衡3. 从-20冰箱中取出的胶条，先于室温放置10-15分钟平衡。4. 配制胶条平衡缓冲液I，在平衡缓冲液I、II干粉中各加入13.35ml 30%的甘油，在平衡缓冲液II中加入碘乙酰胺，充分混匀。5在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。6. 将胶条胶面朝上转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，并加入根据胶条长度加入平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上平衡15分钟。加样量见下表: 7. 第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。8. 用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上，凝胶的顶部对着自己。转移和电泳9.将低熔点琼脂糖封胶液进行加热溶解。10.将10电泳缓冲液稀释成1电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。11.第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）13.将IPG胶条从样品水化盘中移出，并完全浸末在1电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。14.将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。15.用镊子轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触，不要在胶条下方产生气泡。16.而后在IPG胶条上注入低熔点琼脂糖，待低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后，将凝胶转移至电泳槽中。17.在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，第一种程序为起始时低电流（5mA/gel/7cm），待样品在完全走出IPG胶条，再加大电流至（15-20mA/gel/7cm），第二种程序为开始时80V约5分钟，以后200V，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。18.电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号。19.进行染色。(三) Bio-Safe考马斯亮兰染色Bio-Safe 胶体考马斯兰是一种预制的染色溶液，它的敏感度介于Coomassie Blue R-250和银染之间。1. 用去离子水清洗凝胶三次，每次10分钟，以去除SDS。2. 加入足够的Bio-Safe Coomassie stain覆盖凝胶，摇荡1小时至过夜。1小时后颜色会逐渐加深。3. 在摇荡下用去离子水清洗凝胶，直到得到理想的对比度。（四）染色后图像扫描 以GS800为例，简要说明凝胶图像扫描 过程： 先开启扫描仪，再开计算机。 将凝胶置于扫描仪上，用纯水小心润湿 胶与扫描仪仪玻璃板之间，使之没有气泡。 并用滤纸小心吸干凝胶周围的水分。 盖上上盖，准备进行扫描1 进行预扫(Prescan)，确定扫描范围2 调整扫描窗口大小3.进行扫描4保存文件（如是别的扫描仪，请保存为TIFF文件格式）5扫描结束后，先用滤纸小心吸干大部分水分，再以棉球或镜头纸小心擦拭镜面。晾干后合上扫描仪盖子。6关闭扫描仪电源。电泳结果图（五）进行软件分析（见PDQuest培训教程）（六）功能研究1已知蛋白，已有抗体，可进行Western Blotting。推荐采用半干转印系统进行半干转印或是转印槽进行湿转。推荐采用化学发光的方法进行，可选用Chemi Doc XRS进行成像2蛋白分子量已知，可采用Experion全自动快速电泳系统进行快速检测3多种抗体，可采用Bio-Plex悬浮芯片系统进行精确检测，并可做蛋白分子间相互作用的检测附1实验注意事项1.双向电泳中所用的化学试剂纯度要高，至少为分析级。尽量选用进口试剂。2.双向电泳中使用MilliQ水（电导小于1mS）。3.所有包含尿素的溶液加热温度不超过30，否则会发生蛋白氨甲酰化（一）等电聚焦1. 配好的尿素储液必须马上使用，或用mixed-bed离子交换树脂，清除长时间放置时尿素溶液中形成的氰酸盐，预防蛋白质的甲酰化。2. 将水化上样缓冲液分装后再储存于-20。用时，只要解冻需要量，其余继续储存。水化上样缓冲液一旦溶解不能再冷冻。3. 将水化上样缓冲液加入蛋白样品中，终溶液中urea的浓度需6.5M。4. 等电聚焦溶胀缓冲液和样品溶液中都要加入两性电解质，它能够帮助蛋白质溶解。两性电解质的选择取决于IPG胶条的pH范围。下图可提供参考。IPGpH RangeBio-Lyte Ampholyte(Stock)Range Conc.(w/v)Sample Solution VolumePer 5ml per50ml3-103-1040%25ul250ul4-74-640%12.5ul125ul5-740%12.5ul125ul3-63-520%25ul250ul4-640%12.5ul125ul5-85-840%25ul250ul7-107-940%12.5ul125ul8-1020%25ul250ul5. 下表显示的是通常推荐使用的双向电泳第一向蛋白上样量。因为样品和样品之间存在差异，所以这种上样量仅提供参考。对于窄pH范围的IPG胶条，需要比宽pH范围的IPG胶条上更多的样品，这是因为pI值不在此范围内的蛋白质在等电聚焦的过程中会走出胶条。单pH范围IPG胶条的上样量是通常的4-5倍还多，这样就可以很好的检测低丰度的蛋白质。IPG胶条的长度分析型的上样量（银或SYPRO Ruby染色）制备型的上样量（考马斯亮蓝染色）7 cm10-100ug蛋白200-500ug蛋白11cm50-200ug蛋白250-1,000ug蛋白17cm100-300ug蛋白1-3mg蛋白6. 样品溶液的上样体积见下表。这样就可以使胶条溶胀至它们原来的厚度（0.5mm）。胶条最少需要经过11小时的溶胀。即使看上去所有的缓冲液都已经被吸收，也一定要确保胶条在槽中溶胀充分的时间。只有在IPG凝胶的孔径已经溶胀充分后，才可以吸收大分子量蛋白质，否则大分子量蛋白质无法进入胶条。ReadyStripTM IPG胶条的长度上样体积7 cm125ul-250ul11cm185ul-370ul17cm300ul-600ul7. 如果在等电聚焦过程中，聚焦盘中还有很多的溶液没有被吸收，留在胶条的外面，这样就会在胶条的表面形成并联的电流通路，而在这层溶液中蛋白质不会被聚焦。这就会导致蛋白的丢失或是图像拖尾。为了减少形成并联电流通路的可能性，可以先将胶条在溶胀盒中进行溶胀，然后再将溶胀好的胶条转移到聚焦盘中。在转移过程中，要用湿润的滤纸仔细地从胶条上吸干多余的液体。8. 带上手套用镊子去除IPG胶条上的保护层。将IPG胶条仔细的置于溶胀缓冲液上，胶面朝下，确保整个胶面都能被浸湿。9. 在样品溶液中加入痕量的溴酚蓝对观察溶胀过程很有帮助。在覆盖矿物油之前，可以让胶条先吸收1小时的液体。IPG胶条上一定要覆盖矿物油，否则缓冲液会蒸发，使得溶液浓缩，导致尿素沉淀。作为防止缓冲液蒸发的预防措施，矿物油必须缓缓地加在每个槽内，确保完全的覆盖住每一根胶条。10. 下面的表格给出了建议使用的IPG胶条运行的总volt-hours。这仅提供参考，不同的样品需要的volt-hours不同。当聚焦过程无法达到最高电压时，只要最后能达到总的volt-hours，且7cm胶条电压不低于3000伏，11cm胶条电压不低于5000伏，17cm胶条电压不低于7000伏，也能对样品进行充分的聚焦。ReadyStrip IPG胶条的长度最高电压建议的Volt-Hours7 cm8,000V8,000-10,000V-hr11cm8,000V20,000-40,000V-hr17cm10,000V30,000-60,000V-hr11. 为使样品进入胶的效率增加，采用50V低电压溶胀；继续以低电压梯度（200V，500V，1000V各一个小时）进行电泳，最后达到10000V进行聚焦。12. 处理预制IPG胶条时，一定要始终带着手套。注意预防角蛋白污染。13. 水化上样缓冲液的成分由不同的样品决定。14. 每根胶条蛋白质的总上样量由特定的样品，胶条的pH范围，及最终的检测方式决定。下表是进行银氨染色时的蛋白质上样参考。ReadyStrip7cm11cm17cm3-105-100ug20-200ug50-300ug4-710-150ug40-200ug80-300ug3-610-150ug40-200ug80-300ug5-810-150ug40-200ug80-300ug7-1020-200ug50-300ug100-300ug15. 所有包含尿素的溶液加热温度不超过30，否则会发生蛋白氨甲酰化。引起蛋白质pI值的偏移。16.主动水化过程，会帮助大分子量的蛋白质进入胶条，但会丢失部分小分子量蛋白。17.当样品中含盐量较高时，建议选用慢速升压。当样品中含盐量一般时，选用线性升压。当样品中含盐量很少时，可以选用快速升压，这样可以节省聚焦时间。18.虽然仪器中每根胶条的极限电流可以设为99mA/根。但一般胶条的极限电流不超过50mA/根。19.可以在聚焦盘或水化盘的两端电极处搭上盐桥，这可以帮助除盐。但需注意的是，盐桥必须是湿润的但水不能太多，必要时需用滤纸吸去多余的水份。保持盐桥与电极的紧密接触。20. 程序设置中的除盐步骤，可根据具体情况进行设置，如果样品中含盐量较高可设置多步除盐，并加长除盐时间。但这种方法只能除去很少量的盐离子，所以最好是在上样前，对样品进行除盐处理。 （二）胶条的平衡1.不同长度的胶条，选用不同体积的胶条平衡缓冲液。可参考下表。胶条的长度7cm11cm17cm胶条平衡缓冲液I2.5ml4ml6ml胶条平衡缓冲液II2.5ml4ml6ml2. 从冰箱中取出得胶条一定要先解冻。3. 胶条平衡缓冲液I和胶条平衡缓冲液II都要现配，因为DTT和碘乙酰胺在室温的半衰期很短。4. 平衡过程导致蛋白丢失约5%-25%，还会使分辨率降低，平衡30分钟时，蛋白带变宽40%，所以平衡时间不可过长。如果不经平衡，把等电聚焦凝胶直接放在第二向凝胶上会导致高分子量蛋白的纹理现象，并且等电聚焦凝胶会粘在SDS胶上。缩短平衡时间可以减少扩散，但同时会减少向第二向的转移。所以平衡时间要充分长（至少210分钟），但也不要超过（215分钟）。5平衡缓冲液包括Tris-HCl（pH8.8），SDS（2%），高浓度尿素（6M）和甘油（20%）提高蛋白的溶解度并减少电内渗。第一部加入DTT（1%）是为了使蛋白去折叠；第二步加入碘乙酰胺是为了去除多余的DTT（银染过程中，DTT会导致电脱尾）。6.对于非常疏水的蛋白或含有二硫键的蛋白，相对于DTT和碘乙酰胺，TBP（tributylphosphine）更有效。（三）胶条的转移1在琼脂糖中加入少量的溴酚蓝，可以观察到电泳的进程。2琼脂糖的温度不能太高，热的琼脂糖会加速平衡缓冲液中尿素的分解。3当用琼脂糖覆盖胶条时，常会在胶条的下面或背面形成气泡。这些气泡会干扰蛋白质的迁移，所以必须去除。通常在刚加入琼脂糖后，赶快用镊子、压舌板或平头针头轻压胶条塑胶支撑膜的上方，驱赶气泡。4如果选用的是普通琼脂糖，先将胶条推进玻璃板中，使之与第二向凝胶紧密接触，然后再加入琼脂糖封胶液。这是因为普通琼脂糖熔点较高，凝固较快。（四）SDS-PAGE凝胶电泳1玻璃板一定要清洗干净，否则在染色时会有不必要的凝胶背景。2过硫酸铵（Ap）要新鲜配制。40%的过硫酸铵储存于冰箱中只能使用2-3天，低浓度的过硫酸铵溶液只能当天使用。3蛋白质从一向（IPG胶条）到二向（SDS凝胶）的转移为避免点脱尾和损失高分子量蛋白，应缓慢进行（场强小于10V/cm）。4. 用Mini Protein 3电泳槽时，以电流为标准，开始进样的低电流为5mA/gel，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电流到10-15mA/gel；以电压为标准，开始进样的低电压为50-75V/gel，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电压到150-200V /gel。用Protein II电泳槽时，以电流为标准，开始进样的低电流为10mA/gel，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电流到20-30mA/gel；以电压为标准，开始进样的低电压为75-100V /gel，待样品在浓缩胶部分浓缩成一条线后，再加大电压到300-400mA/gel。附2 聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶的配方表1 配制Tris-甘氨酸SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液溶液成分不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）51015202530405012% 水1.63.34.96.68.29.913.216.5 30%丙烯酰胺溶液246810121620 1.5 mol/L Tris (pH8.8)1.32.53.856.37.51012.5 10% SDS0.050.10.150.20.250.30.40.5 10%过硫酸氨0.050.10.150.20.250.30.40.5 TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.0230% 聚丙烯酰胺贮液丙烯酰胺150g甲叉双丙烯酰胺4gMilliQ水500ml滤纸过滤后，棕色瓶4冰箱保存。1.5mol/L Tris碱 pH8.8Tris碱90.75gMilliQ水400ml用1mol/L HCl调pH至8.8，加MilliQ水定容至500ml。4冰箱保存。10% SDSSDS10gMilliQ水100ml混匀后，室温保存。10% ApAp0.1gMilliQ水1ml（用时加水溶解）溶解后，4冰箱保存。10电泳缓冲液（1= 25mM Tris，192mM glycine，0.1% SDS，pH8.3）Tris碱30g甘氨酸144gSDS10gMilliQ水1L混匀后，室温保存。十一. IEF使用过程中常见问题及解决方法以下为IEF在使用过程中可能会碰到的问题，详细情况请阅读说明书。如果操作错误或系统错误时，相应的错误信息会显示在液晶屏上。同时系统的电源供应会在错误信息显示时自动切断。问题可