真菌诊断进展.ppt

深部真菌感染的非培养 诊断进展,北京大学第一医院 北京大学真菌和真菌病研究中心 余 进,侵袭性真菌感染率上升,Martin et al, NEJM 2003;348:1546,深部真菌感染不断增加,国内深部真菌感染不容忽视,刘正印等，中华医学杂志2003年3月第83卷第5期,国内情况,我院血液科(2004.5-2005.5共118例患者) 确诊和临床诊断有7例,发生率为5.9% 以血液病为主的深部真菌感染高危患者中，发生感染的危险因素有2种及2种以上广谱抗生素应用、念珠菌菌落定植和应用尿管，其中广谱抗生素应用是最主要的危险因素,深部真菌感染,条件致病性真菌 念珠菌病 曲霉病 隐球菌病 其他,对于侵袭性真菌感染,诊断滞后治疗手段有限 基础疾病 病死率很高 念珠菌血症若不治疗死亡率可以达到45-76%侵袭性曲霉病死亡率高达55-70%,诊断方法,显微镜检查 培养 血清学 分子生物学,镜检和培养方法,敏感性低 血培养：在肿瘤和血液病病人中，50%尸检证实深部念珠菌感染的病例血培养阴性。 培养结果阳性仅表示存在某种真菌，区分定植和感染困难 培养时间长 有些标本采集困难,非培养方法优点,快速报告结果 敏感性提高 取材简便 多以真菌在致病状态产生的物质为检测标志物，结果阳性提示有致病性 定量检测可判断感染严重程度及疗效评估,非培养诊断的方法简介,真菌细胞壁成分 （1-3） - - D-葡聚糖检测（G试验） 真菌抗原检查 半乳甘露聚糖（galactomannan) 抗原（GM试验) 甘露聚糖(mannan)抗原 隐球菌荚膜多糖抗原（乳胶凝集试验） 真菌特异的代谢产物 D-阿拉伯糖醇 真菌 DNA 的检测,深部真菌感染的诊断标准 EORTC/MSG2008修订版,宿主因素 临床特征 病原学 真菌镜检 真菌培养 组织病理学检查 血清学检查方法（间接证据） CSF隐球菌抗原阳性确诊 GM-test, G-test临床诊断,Clinical Infectious Diseases 2008; 46,（1-3） - - D-葡聚糖检测,（1-3） - - D-葡聚糖检测,真菌细胞壁成份，占50%以上 其他微生物、动物及人的细胞不含该成份 用于侵袭性真菌感染的早期诊断,方法：G试验,-葡聚糖可特异性激活鲎（Limulus）变形细胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故称G试验。 Beta-D-glucan 通过激活G因子（ Factor G）引起凝集 内毒素通过激活C因子（Factor C）引起凝集 试剂盒: 祛除Factor C Glucan 特异,BG检测的特点,可检测多种致病真菌感染 念珠菌,曲霉,肺孢子菌,镰刀菌,地霉,组织胞浆菌,毛孢子菌等 不能用于检测隐球菌和接合菌感染 阳性结果代表存在侵袭性真菌感染 真菌对数生长期释放量最大 ,可被体内葡聚糖酶降解(glucanase) 每周检测2次,BG检测用于念珠菌血症,敏感度为62%-100%，特异度为64%-88% 不同种念珠菌感染对葡聚糖检测无明显影响 白念珠菌,光滑念珠菌, 热带念珠菌,克柔念珠菌,季也蒙念珠菌和葡萄牙念珠菌 近平滑念珠菌BG水平较低,Clin.Infect. Dis. 2005.41:654659. J. Clin. Microbiol. 2005.43:59575962 J. Clin. Microbiol. 2008.46:10091013,BG检测用于念珠菌血症,BG检测敏感度明显高于Mannan检测 79.6%vs42% 阳性早于血培养阳性和临床症状出现 对于念珠菌血症, BG检测是首选检查,Clin.Infect. Dis. 2005.41:654659. J. Clin. Microbiol. 2005.43:59575962 J. Clin. Microbiol. 2008.46:10091013,-（1-3）-D-葡聚糖(BG)检测 用于侵袭性曲霉感染（IPA),敏感度为55%-100% 特异度为52%-100% 对于确诊IPA，阳性率为85.7-100% 高度可疑IPA，阳性率为52.4-66%,Med. Mycol. 2006.44:51635172 J. Clin. Microbiol. 2008.46:10091013 J. Clin. Microbiol. 2005.43:299305,BG检测( 阳性界值为60pg/mL)和GM（阳性界值为1.0）比较 二者在体内的代谢动力学相似，敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值均相同，分别为87.5%、89.6%、70%和96.3% 二者联合可以提高特异度和阳性预测值，对敏感度和阴性预测值没有影响 J Clin Microbiol, 2005, 43:299-305.,侵袭性曲霉感染（IPA) BG检测与半乳甘露聚糖(GM)检测,BG检测与半乳甘露聚糖(GM)检测,BG检测与GM检测 敏感度67%vs38% 特异度90%vs100% 感染曲霉种类的影响 抗真菌药物应用的影响 抗生素应用的影响,BG检测,对于烟曲霉和非烟曲霉感染无差别,J. Clin. Microbiol. 2008.published online,GM检测,烟曲霉感染的敏感性明显低于非烟曲霉感染,J. Clin. Microbiol. 2008.published online,抗真菌治疗对GM检测的影响,抗真菌治疗使GM检测敏感性下降 确诊IPA的造血干细胞移植 未接受抗真菌治疗，GM试验的敏感度为87.5% 接受抗真菌治疗，敏感度为20% 应用卡泊芬净后，GM值会出现升高 BG检测的敏感性与抗真菌治疗无明显关系,Clin.Infect. Dis. 2005.40:17621769. Clin.Infect. Dis. 2005.41:654659.,抗生素治疗 对BG检测和GM检测的影响,BG检测 假阳性与应用内酰胺类抗生素无关 Antimicrob. Agents Chemother. 2006.50:34503453. GM检测 哌拉西林/他唑巴坦导致假阳性,IPA的诊断方法,BG检测 GM检测 烟曲霉可能阳性率低 二者联合可以提高检测的阳性率,BG检测用于肺孢子菌检测,BG是肺孢子菌包囊壁的组成成分 可释放入血液 可用于肺孢子菌检测,BG检测,57名PCP患者 238名非PCP患者 敏感度92%，特异度86% 阳性预测值0.61，阴性预测值0.96 界值31.1pg/mL CHEST 2007;131:1173-1180,BG检测用于PCP诊断,敏感度好 临床一致性好 数值升高明显，甚至高于念珠菌感染 PCP( 1,299- 1,151 pg/ml; median, 945 pg/ml) 念珠菌血症 ( 700- 779 pg/ml; median, 447 pg/ml).,J. Clin. Microbiol. 2008.46:10091013,（1-3） - - D-葡聚糖(BG) 检测方法,Fungitec-G (Japan) 界值为20pg/mL Fungitell(US) 界值为60pg/ mL或80pg/mL GKT-5M Set动态真菌检测试剂盒 (国内金山川公司) 界值为20pg/mL 或50pg/mL,Fungitec-GTM,20pg/mL 41名确诊IA患者中有37名阳性 59名无真菌感染的肿瘤或结缔组织病的对照中，无一例阳性 J Clin Microbiol, 1995, 33:3115-3118 202名发热患者 敏感度和特异度分别为90%和100%，阳性预测值为59%，阴性预测值为97% Lancet, 1995,345:17-20.,FungitellTM,60pg/mL ，80pg/mL 60pg/mL 敏感度70%，特异度87% 80pg/mL 敏感度64%，特异度92%,Clin Infect Dis, 2005, 41:654-659.,GKT-5M Set动态真菌检测试剂盒,对于侵袭性念珠菌感染 以健康人做对照 敏感度88.9%, 特异度90.2% 阳性预测值50%, 阴性预测值98.7% 界值定为13.7pg/ml,中国真菌学杂志，2007，2（4）：202-206,GKT-5M Set动态真菌检测试剂盒,北京大学第一医院2008年4月至2008年8月住院患者临床怀疑侵袭性真菌感染的患者98例 50pg/mL BG50pg/mL 15例，IFI组7例 敏感度63.6%，阳性预测值46.7% BG50pg/mL 83例，对照组79例 特异度90.8%，阴性预测值为95.2%,假阳性问题,污染（无热源的试管、枪头和蒸馏水等） 血液透析、腹膜透析 纱布或其他医疗物品（外科手术） 某些品牌的静脉制剂（白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白等） 抗肿瘤多糖（香菇多糖） 某些细菌败血症患者（尤其是链球菌败血症） 假阳性与应用内酰胺类抗生素无关 对策: 动态监测葡聚糖的变化,总结,BG检测可以早期、快速诊断侵袭性真菌感染，可用于真菌感染早期筛查 适用于念珠菌,曲霉,肺孢子菌,镰刀菌,地霉,组织胞浆菌,毛孢子菌等 不能用于检测隐球菌和接合菌感染 敏感度为64-93%，特异性为90%（国内） 与GM试验联合可提高阳性率 2次或2次以上阳性可降低假阳性率 高危患者建议每周检测1-2次,半乳甘露聚糖抗原检测 （GM试验）,GM抗原检测原理,曲霉galactomannan antigen 大鼠EBA-2单克隆抗体 双抗夹心法,GM试验,敏感度为0.71，特异度为0.89 血液系统恶性病中，其敏感度和特异度分别为0.7和0.92 骨髓移植患者中，其敏感度和特异度分别为0.82和0.86 实体器官移植患者中，敏感度下降到0.22，特异度为0.84 成人敏感度和特异度分别为0.62和0.87 儿童敏感度和特异度分别为0.89和0.85 ,文章较少（仅有2篇），但是呈现出较高的敏感度和特异度。,假阳性,哌拉西林/他唑巴坦 Gluconate 与其它的细菌或真菌成分有交叉反应 皮炎芽生菌、黑孢霉、拟青霉、产黄青霉、马尔尼菲青霉、粉红单端孢、头状地霉等 肠道中定植的曲霉释放GM进入血液循环 谷类食物中的GM抗原,曲霉感染检测的影响因素,半乳甘露聚糖在血中存在时间短，建议： 高危人群每周至少检测2次 结合影象学、培养结果综合分析诊断 结果判定标准 界值的确定 抗真菌治疗情况,GM试验,试剂盒推荐界值为1.5时 灵敏度为64.7%, 特异度为93.5% 连续2次1.5为阳性 灵敏度为63.6%，特异度为85.7%,临床皮肤科杂志，2005，34（12）：816-817,中华内科杂志，2006，42（12）：992-995,GM试验,对于46例造血干细胞移植后患者的167份血样进行GM抗原的测定，发现以单次测定大于1.0，或者连续2次大于0.8为阳性标准，试验的灵敏度和特异度均较高，根据上述界值，该试验的灵敏度为81.8%，特异度为93.3%。,中华医学杂志，2007，28（2）：83-86,GM界值,FDA将界值定为0.5 界值从1.5降到0.5 敏感度从76.3%升到97.4%- 21% 特异度从97.5%降到90.5%- 7% 连续2次I0.5,阳性预测值更好,Clin Infect Dis. 2007,抗真菌治疗的影响,确诊侵袭性曲霉病的造血干细胞移植 未接受抗真菌治疗，GM试验的敏感度为87.5% 接受抗真菌治疗，敏感度为20% 治疗开始后半乳甘露聚糖的测定值会下降，未见下降意味着治疗失败 应用卡泊芬净后，半乳甘露聚糖值会出现升高,GM in BAL,不同人群对结果的解释不同 血液系统恶性病、造血干细胞移植 BAL中GM值的升高能够提高IPA诊断的灵敏度 实体器官移植（肺移植除外） 特异度为92.9%,PPV为62.5% 无免疫抑制的ICU患者 敏感度为88%，特异度为87% 免疫正常的患者和肺移植患者 假阳性高（菌落定植） 对于无免疫抑制的患者建议同时检测血液和BAL的GM,隐球菌乳胶凝集试验,隐球菌LA检测,荚膜抗原,隐球菌乳胶凝集试验,多克隆IgG抗体 敏感性可达99%,假阴性 前带效应 解决方法：稀释,假阳性 与类风湿因子、丝孢酵母菌、DF-1菌感染血清有交叉反应 解决方法：采用单抗、标本前处理,隐球菌性脑膜炎,涂片墨汁染色法检出隐球菌的阳性率分别为64.86% 乳胶凝集试验检测患者血清和脑脊液中隐球菌荚膜多糖抗原的阳性率分别为91.67%, 100%,第二届全国深部真菌感染学术会议 ，2007.3.15-3.18，杭州,分子生物学方法,分子生物学方法,以PCR和分子杂交技术为基础 巢式PCR PCR-ELISA Real-time PCR 反向线点杂交 生物芯片,PCR方法,敏感度、特异度差异较大 4%-100%, 7.9%-100% 差异原因 1 真菌DNA的提取效率 2 引物质量 3 PCR反应种类（普通PCR，巢式PCR或者实时定 量PCR） 4 研究人群的大小，基础疾病 5 样本种类（血浆、血清、全血或者支气管肺泡灌 洗液） 缺乏标准化方法,DNA检测用于IPA,DNA检测结果与半乳甘露聚糖检测和高分辨率CT的结果有良好的一致性 DNA检测阴性基本可