2免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计.ppt

HRP标记单抗建立Elisa夹心法测定相应抗原含量,汇报人：闫斯楠 时间：13.7.6,一、CEA介绍,大肠癌组织可产生一种糖蛋白，作为抗原引起患者的免疫反应。此种抗原称为癌胚抗原（carcino-embryonic antigen CEA），可广泛存在于内胚叶起源的消化系统癌，也存在于正常胚胎的消化管组织中，在正常人血清中也可有微量存在。 癌胚抗原是一个广谱性肿瘤标志物，它能向人们反映出多种肿瘤的存在，对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预后估计是一个较好的肿瘤标志物。,二、方案设计,常规夹心法 CEA抗体1-抗原-CEA抗体2-二抗（HRP标记）,本实验夹心法 CEA抗体1-抗原-CEA抗体2（HRP标记）,该方案是直接法与夹心法的有效结合，兼具两者的优点。为目前市面上Elisa检测试剂盒的通用发法。,三、主要技术方法,1. Elisa,A.实验步骤： 1.抗原预包被。用包被缓冲液将抗原稀释（浓度由预实验确定），每孔加入200微升，37孵育1小时后，4放置16-18小时。 2.洗涤。倒尽板孔中液体，加满洗涤缓冲液，静止3分钟后倒掉。反复3次，最后一次尽量拍干板孔中剩余液体。 3.加封闭缓冲液每孔200微升，37放置1小时。 4.同2步洗涤。 5.加被测血清100微升（做梯度稀释），并作阳性、阴性及空白对照。37放置1小时或者4过夜。 6.同2步洗涤。 7.加二抗。50微升每孔加入适宜浓度的二抗，37摄氏度放置1小时。 8.同2步一样洗涤，并多重复一次，最后一次重复后一定要排干所有水分，否则会有假阳性出现。 9.显色。每孔加入底物溶液100微升，室温暗处放置10-15分钟，然后用终止液终止显色。 10.酶标仪读数。,B.需要配制的试剂 1.包被缓冲液：0.05M pH9.6碳酸缓冲液，4保存 Na2CO3 0.15g NaHCO3 0.293g 稀释至100ml 2.洗涤缓冲液：0.01M pH7.4 PBS-Tween-20，室温保存 NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g Na2HPO412H2O 2.9g 或者Na2HPO4 1.15g Tween-20 0.5ml(用前临时加入) 稀释至1000ml 3.封闭缓冲液：在洗涤缓冲液中加入5%脱脂奶粉或者10%BSA或者0.5%鸡卵清蛋 白。（用时现配） 4.稀释缓冲液：在洗涤缓冲液中加入0.1%BSA。（用时现配） 5.显色终止液：2M H2SO4，室温保存 蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸21.7ml，并边加入边混匀。 6.底物缓冲液：pH5.0磷酸棗柠檬酸，4保存 Na2HPO4 7.298g 柠檬酸 4.669g 加水至1000ml 7.底物溶液： TMBS底物使用液（用时现配），450nm显色 TMBS（1mg/ml无水乙醇） 1.0ml 底物缓冲液 10ml 1%H2O2 25微升,2. HRP标记CEA单抗2,戊二醛二步法和过碘酸钠法 .戊二醛二步法 A.原理： 戊二醛为一种双功能试剂，通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共 价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。,B.标记步骤： (1) 称取HRP25mg溶于1.25戊二醛溶液中，于室温静置过夜。 (2) 反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱，用生理盐水洗脱。流速控制在1ml1分钟，收集棕色流出液。如体积大于5ml，则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中，缓慢搅拌。 (3) 将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml，搅拌下逐滴加入酶溶液中。 (4) 用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml，继续搅拌3小时。 (5) 加0.2M赖氨酸0.25ml，混匀后，置室温2小时。 (6) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置41小时。 (7) 3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于 少量0.15M PH7.4的PBS中。 (8) 将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。,C. 需要配制的试剂： (1) 0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)： 取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸馏水至200ml。 (2) 1.25戊二醛液： 取25戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。 (3) 1M PH9.5碳酸盐缓冲液： 取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。 (4) 0.2M赖氨酸溶液： 称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。 (5) 0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。 (6) PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。 (7) 萘氏试剂及聚乙二醇(PEG，MW2000)。 (8) 纯化的特异性抗体或抗Ig抗体（购买）。 (9) HRP(RZ3.0)（购买）。,D.优缺点 本法标记步骤比较简单，重复性好。缺点是酶的利用率低，一般只有24的酶与蛋白质结合。,.过碘酸钠法 A.原理： HRP经NaIO氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏碱，后者可进一步用NaBH(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。,B.标记步骤: (1) 称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。 (2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO溶液，室温下避光搅拌20分钟。 (3) 将上述溶液装入透析袋中，对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4过夜。 (4) 加20l 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的PH升高到9.09.5，然后立即加入10mg IgG(抗体，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。 (5) 加0.1ml新配的4mgml NaBH液，混匀，再置42小时。 (6) 将上述液装入透析袋中，对0.15M PH7.4 PBS透析，4过夜。 (6) 在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置41小时。 (7) 3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。 (8) 将上述溶液装入透析袋中，对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。,C.需要配制的试剂 (1) 0.1M NaIO：称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂)溶于蒸馏水10ml中。 (2) 1mM PH4.4醋酸钠缓冲液: 0.2M NaAc (1.361克50ml) 3.7ml 0.2M HAc (0.601ml50ml) 6.3ml 加蒸馏水至2,000ml。 (3) 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液: NaCO 0.32克 NaHCO 0.586克 加蒸馏水至50ml 再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。 (4) NaBH溶液(4mgml): 临用时称取NaBH4mg溶于1ml蒸馏水中。 (5) 其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。,D.优缺点 本法所获酶标记抗体的产率高，将近70的HRP和Ig结合，99的Ig与酶结合，酶与Ig的活性无重大损失，是目前最常用的方法。,3. Sephadex G-25层析,A.分离原理 ： 当混合样液加到凝胶柱上，随着洗脱剂而通过凝胶柱时，分子大小不同的物质受到不同的阻滞作用。颗粒接近或大于网眼的分子，不能进入凝胶的网眼中，在重力作用下它们随着溶剂在凝胶颗粒之间沿较短流程向下流动，受到的阻滞作用小，移动速度快，先出层析柱（此现象叫作被排阻。被排阻的最小分子量称为该规格凝胶的排阻极限）；而颗粒小于网眼的分子可渗入凝胶网眼之中，它们被洗脱时不断地从一个网眼穿到另一个网眼，逐层扩散，阻滞作用大，流程长，移动速度慢，因而后出层析柱。在层析柱的出口处，我们用多个试管分步收集洗脱液，就可将混合物中各组分彼此分离。 当我们从生物组织中用盐析法提取蛋白质后，常需要进行蛋白质的脱盐工作，我们可采用层析介质为葡聚糖凝胶G-25，用适当的洗脱剂进行洗脱，经凝胶层析，就可以将大分子蛋白质与小分子盐类分离。,B.试剂的配制 1. 葡聚糖凝胶-25 溶胀凝胶方法：按每个层析柱约4g的量称取葡聚糖凝胶G-25于烧杯中，加过量蒸馏水于沸水浴中溶胀2小时或在室温下溶胀6小时以上。用倾泻法除去上层漂浮的细碎凝胶，重复34次。操作中避免剧烈搅拌，防止破坏其交联结构。 2. BaCl2溶液（1%） 3. 考马斯亮蓝G-250 称取0.1g考马斯亮蓝G-250，先溶于50mL95%乙醇中，再加入85%的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。暗处存放。 4. 脲（6mol/L） 5. 洗脱剂 常规PBS,C.操作步骤 1. 层析柱的准备 (1) 清洗：每组取一支层析柱，用清水冲洗干净。 （若玻璃柱较脏，应卸去塑料装置，先入洗液中浸泡2小时。） (2) 安装与检查：检查出口装置中尼龙绸或烧结滤板是否完好干净。安装层析柱，让其垂直固定于滴定台架上。对准出口处，放一只250mL烧杯。向层析柱内灌洗脱剂，打开出口螺旋夹，检查有无渗漏、出口乳胶管是否通畅等情况。 (3) 排气泡：保持柱内一定的水位，用手指弹击柱壁，部分气泡会从溶液中上浮排出。出口处的小气泡易停留在螺旋夹附近的乳胶管内，要想法排尽，否则会影响分离结果，排气完毕，保留柱内12cm高水位，关紧螺旋夹。 (4) 标记高度：在距顶端810cm处做一标记，作为衡量灌装层析介质床体高度（1517cm）的依据。 2. 装柱 每组用50mL烧杯取溶胀的凝胶悬浆2530mL，静置片刻，观察凝胶沉淀与水的体积之比，约为1:1即可，否则应作调整。 轻轻搅匀杯中凝胶，用玻璃棒引流入柱，打开出水口，并不断地向柱内补充凝胶，直到凝胶沉淀高度位于标记上方约2cm为止，凝胶柱内若有气泡和断层或柱床表面干水和歪斜，都将影响分离效果。必要时，需倒出凝胶，重新装柱。,3. 平衡 取15mL洗脱剂，用滴管沿柱内壁旋转着缓缓流下，不可冲动胶平面，打开出水口，经洗脱液的流动，一方面清洗内壁，另一方面使胶床收紧。洗脱平衡完毕，胶床上方保留约4cm高水位，关闭出水口。此时，胶床高度15cm为宜。 4. 准备收集 取6只干净的刻度试管（除净试管内残留的水），16编号，并在试管2mL处作一标记，插入试管架上，为收集洗脱样品作好准备。 5. 上样与收集 打开出口排水，当胶床与上方水层的弯月面相切时，关闭出口，用滴管将0.2mL混合样液沿柱内壁缓缓加入，勿冲动胶面。上样完毕，打开出水口，开始收集一号管。每管收集洗脱液2mL。 当样液进入胶床，其弯月面与胶平面相切时，暂停排液，用滴管将洗脱剂沿柱内壁旋转着加入1cm高水位，然后排液，至其弯月面与胶平面相切，再缓缓注入35cm高的洗脱剂。,6. 洗脱 不断向柱内加洗脱剂，保持胶床上水位35cm。出口流速控制在每6秒1滴，直至收集到6号管达2mL时，关闭出口。 7. 鉴定 另取6只干净试管，按收集顺序将洗脱液一分为二，即每管1mL，依次在试管架上排成二排。 第一排每管加2滴BaCl2，根据白色沉淀多少，判断SO42-在各管中的浓度。 第二排每管加1mL考马斯亮蓝G-250试剂，根据蓝色情况，判断蛋白质在各管中的浓度。将结果记录于下表中。 若鉴定的第6号管中，仍有样品，表明洗脱和收集不够，需增加7号、8号试管继续洗脱与收集，同上法鉴定其蛋白质和盐浓度情况。 管 号 项 目 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 白色沉淀量 蓝色深浅 8. 再生 鉴定完毕，打开出水口，继续用倍床体积洗脱剂洗脱，洗脱后关闭出口，以备下次使用。,四、实验所需购买材料、试剂,13.7.21日 过碘酸钠法标记HRP于鼠单抗 标记结束，结果如下： 利用BioTec多功能微孔板检测仪检测标记物的OD280nm及OD403nm OD280nm=0.674 OD403nm=0.438 IgG量（mg/ml）=（OD280nm-OD403nm*0.3）*0.62=0.336412 酶量（mg/ml）=OD403nm*0.4=0.1752 克分子比值（E/P）=酶量*4/IgG量=2.08315 即2.08315个HRP分子结合在一个抗体分子上。 酶结合率=酶量*体积/抗体=52.08% 标记率0.6,经过多次ELISA验证HRP标记成功的单抗的可用性,HRP标记单抗效价测定（间接法）： 抗原（包被）+HRP标记的鼠单抗+TMB及终止液显色,由以上数据可看出，HRP标记的单抗效价为最高1:100，但由于ELISA阳性值在1以上（同时不能过大）为最佳选择，故后续实验应选择1:50稀释酶标单抗，这个效价为HRP标记前的单抗效价的50%，即本方法标记单抗导致单抗效价降低50%。,使用HRP酶标单抗构建测定抗原（羊肚菌菌丝）含量的标准曲线,抗原捕获量测定（双抗夹心法）： 兔多抗包被+梯度浓度抗原+HPR标记鼠单抗+TMB及终止液显色,免疫磁珠在ELISA中的应用及方案设计,汇报人 闫斯楠 日期 2013.9.1,目录,1.免疫磁珠技术简介 2.免疫磁珠技术的应用及优缺点 3.免疫磁珠与ELISA联用的方案设计,1.免疫磁珠技术简介,1.1 免疫磁珠的结构 免疫磁珠（IMB），也称免疫磁性微球，是一种均匀、具有超顺磁性及保护性壳的球形小粒子，基本上有载体微球和免疫配基结合而成。其核心为顺磁性粒子，核心外层包裹一层高分子料，最外层是免疫配基。,免疫磁性微球结构,免疫磁珠,载体微球,载体微球,磁性物质,高分子层,功能基,金属小颗粒（Fe2O3、Fe3O4）,如聚乙烯亚胺、聚乙烯醇、聚醋酸乙烯酯、聚丙烯酸、酶类、多糖（淀粉、纤维素、葡聚糖、果胶等）、球蛋白和牛血清白蛋白等,如氨基、羧基、羟基，使其表现具有疏水-亲水、非极性-极性、带正电荷-带负电荷等不同的物理性质,免疫配基,免疫配基通过生物高分子的功能基团结合到磁性载体微球上形成免疫磁珠。由于载体微球制备材料和方法不同，其表现出的物理性质也不同，从而可结合不同的免疫配基，如抗原、抗体、凝集素、DNA和RNA等。配基必须具有生物专一性的特点，而且载体微球与配基结合要不影响或改变配基原有的生物学特性，保证磁珠的特殊识别功能。,1.2 免疫磁珠的性质,由于免疫磁珠的大小和形状具有均一性，从而可使靶物质迅速和有效地结合到磁珠上，也可使生成的新复合物在磁场中具有相同的磁响应性，且行为一致 磁珠的球形结构可消除与不规则形状粒子有关的特异性结合 顺磁性可使磁珠置于磁场时显示其磁性，并做定向移动，从磁场移出时磁性消除，磁珠分散，由此可方便地进行分离和磁性导向 保护性壳可防止磁性内核漏出或被载液腐蚀 免疫配基可特异性地结合反应体系中相应的抗原、抗体、核酸等生物活性物质,1.3 免疫磁珠技术,免疫磁珠（IMB）技术：是一种以特异的抗原抗体反应为基础的免疫学检测和分离技术。它是以抗体包被的磁珠为载体，通过抗体与反应介质中